Статья: Энзиматические свойства фактора роста нервов (NGF) и его субъединиц Н.С. Пыжова

Энзиматические свойства фактора роста нервов (NGF) и его субъединиц Н.С. Пыжова

В.Н. Никандров

Аннотация

Изучены энзиматические свойства образцов высокой степени чистоты олигомера NGF и его субъединиц. Обнаружено наличие у [3-субъединицы плазминоген-активаторной способности, а у в- и у-субъединиц - прямой протеолитической активности в отношении основного белка - про- тамина. Ингибиторный анализ свидетельствует о "сериновой" природе этой активности, в молекуле в-субъединицы вероятно наличие функционально значимых металл-содержащих сайтов. Все три субъединицы наделены супероксид-конвергирующий способностью, но только в- и у- субъединицы, по данным биохемилюминесценции, способны разлагать Н 2О 2 с генерированием активных форм кислорода. Плазминоген-активаторная способность в- и у-субъединиц резко - на 70-100% - угнеталась АТР, не изменялась при добавлении 3',5'-АМР, умеренно - на 18-40% - снижалась в присутствии ADP и на 40% возрастала в присутствии АМР. Активность в- субъединицы и у-субъединицы угнеталась в присутствии GTP на 100 и 40% соответственно. У всех трех субъединиц обнаружена способность к расщеплению ДНК и РНК. Эффекторный анализ и концентрационная зависимость дают основание считать, что субъединицы самостоятельны в этой активности и нет каких-либо взаимопримесей. Обработка а-субъединицы источниками активных форм кислорода не привела к проявлению протеолитической активности. Вместе с тем ее молекула имеет активный центр, наделенный активностью нуклеазной.

Ключевые слова: фактор роста нервов, субъединицы, плазминоген-активаторная способность, протеолитическая активность, разложение Н 2О 2, конверсия супероксидного радикала, пуриновые нуклеотиды, нуклеазная активность энзиматический олигомер активность

ENZYMATIC PROPERTIES OF NERVE GROWTH FACTOR (NGF) AND ITS SUBUNITS PYZHOVA Nelly S

NIKANDROV Vitaliy N.,

The enzymatic properties of high purity samples of the NGF oligomer and its subunits were studied. The presence of plasminogen-activating ability in the в-subunit, and direct proteolytic activity in relation to the basic protein, protamine, in the fi- and y-subunits was found. The inhibitory analysis indicates the "serine" nature of this activity; the presence of functionally significant metal-containing sites in the fi- subunit molecule is likely. All three subunits are endowed with the superoxide-converging ability, but only fi- and y-subunits, according to biochemiluminescence data, are able to decompose H2O2 with the generation of reactive oxygen species. The plasminogen-activating ability of fi- and y-subunits was sharply - by 70-100% - inhibited by ATP, did not change with the addition of 3',5'-AMP, moderately - by 18-40% - decreased in the presence of ADP and by 40 % increased in the presence of AMP. The activity of the fi- subunit and y-subunit was inhibited in the presence of GTP by 100 and 40%, respectively. All three subunits were found to be able to cleave DNA and RNA. Effector analysis and concentration dependence give reason to believe that the subunits are independent in this activity, and there are no mutual impurities. Treatment of the a-subunit with sources of reactive oxygen species did not lead to the manifestation of proteolytic activity. At the same time, its molecule has an active center endowed with nuclease activity.

Keywords: nerve growth factor, subunits, plasminogen-activating ability, proteolytic activity, H2O2 degradation, superoxide radical conversion, purine nucleotides, nuclease activity

Введение

Фактор роста нервов (КОБ) - один из нейроспецифических белков регуляторного типа. Его считают ответственным за дифференцировку и пролиферацию адренергических симпатических и сенсорных нейронов периферической нервной системы, холинергических нейронов базальных ядер переднего мозга, регенерацию нервов, нейронов развивающейся нервной системы, включая ноцицепторы. Установлено участие его в симпатической передаче возбуждения, Са ²+- зависимой стимуляции выхода ацетилхолина, дифференцировку, пролиферацию и биосинтетические свойства клеток иммунной системы [1-4].

Было установлено, что КОБ - основной белок-олигомер 118 аминокислотных остатков общей молекулярной массы 131 кДа, содержащий 1-2 атома цинка. Олигомер 78 КОБ состоит из двух а-субъединиц, двух Р- субъединиц (они образуют димер в составе олигомера КОБ) и двух у-субъединиц. Плазминоген-активаторная активность присуща олигомеру фактора 78 и его у-субъединице, тогда как а- и Р-субъединицы ее лишены [5, 6]. Протеиназой является у-субъединица, принадлежащая к калликреиновому семейству сериновых протеиназ, тогда как а- субъединица - неактивная протеиназа [7] и лишена специфической биологической активности [8].

Активность у-субъединицы ингибируется диизопропилфторфосфатом, она неспособна расщеплять фибрин или казеин, при этом гидролизует синтетические эфиры аргинина Г-субъединица КОБ катализирует расщепление К-бензоил-Ь-аргинин-этилового эфира, причем добавление к ней очищенных а- или Р-субъединиц существенно не отражалось на этой активности в 0,05 М трис- буфере при рН 7,0, 8,0 и 9,0, тогда как активность смеси (у- + а- + Р)-субъединиц снижалась при рН 7,0 и 8,0 (но не при рН 9,0) на 80 и 49% соответственно. Расщеплялся также и ТАМЕ, но гораздо слабее. По расщеплению ВАЕЕ и ТАМЕ при рН 7,0 у-субъединица превосходила трипсин в 6,7 и 2,1 раза соответственно [10].

Однако, несмотря на многолетние исследования свойств молекулы КОБ и его субъединиц, до сих пор остается не совсем ясной природа его биологической активности на молекулярном уровне. Среди данных литературы о функциональных свойствах КОБ и его субъединиц примечательным было обнаружение у у-субъединицы плазминоген-активаторной способности (см. выше по тексту). Вместе с тем, считали, что остальные субъединицы (Р- и а-) лишены подобных свойств. Таково было положение до начала наших работ.

В настоящей статье полностью раскрыты результаты проведенных нами экспериментальных исследований, основные результаты которых были получены в 1998-2001 годы. Эксперименты были проведены на базе лаборатории регуляторных белков и пептидов Института физиологии НАН Беларуси и лаборатории биохимии НИИ эпидемиологии и микробиологии Минздрава Республики Беларусь. Результаты их изложены в целом ряде тезисов и фрагментах статей [11-23], но по ряду причин в то время статья так и не была написана. Методическая сторона этих исследований раскрыта в ранее опубликованных нами статьях [24-27].

Образцы фактора роста нервов - 78 и его субъединиц выделены из подчелюстных слюнных желез белых мышей-самцов сотрудниками лаборатории регуляторных белков и пептидов Института физиологии НАН Беларуси и предоставлены старшим научным сотрудником В.С. Лукащевичем. Процесс выделения и очистки включал гомогенизирование, осаждение сульфатом аммония, хроматографию на сефакриле 8-200, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе, ультрафильтрацию и рехроматографию на сефакриле 8200 [28]. Полученные образцы имели активность 20 нг/биол. ед.

Субъединицы фактора выделяли как описано ранее методом диссоциации в кислой среде [1]. Их гомогенность подтверждена методами гель-хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле и изоэлектрофокусирования в системе амфолинов. Биологическая активность р-субъединицы оценена в тесте с трансформацией клеток феохромоцитомы РС 12.

Результаты и их обсуждение. На первом этапе исследований было установлено, что а- либо у-субъединицы в отсутствие плазминогена не расщепляют фибрин (таблица 1). Правда, под действием у- субъединицы частичный фибринолиз все же проявляялся, что совпадает с изложенным в литературе мнением о принадлежности ее к сериновым протеиназам. Нужно отметить, что урокиназа (ЕС 3.4.21.31) также обладает собственной фибринолитической активностью, которая уступает ее плазминоген-активаторной функции [29]. После добавления к образцам очищенного плазминогена под действием у-субъединицы отмечен четкий фибринолиз, тогда как у а- субъединицы такая способность отсутствовала.

При использовании же плазминогенсодержащих фибриновых пластин был выявлен фибринолиз не только под действием у- субъединицы, но и в присутствии Р- субъединицы фактора (таблица 2). Этот процесс характеризовался продолжительной лаг-фазой в сравнении со стрептокиназой и урокиназой и уступал им по интенсивности. Однако так была впервые обнаружена в 20002002 годы плазминоген-активаторная способность Р-субъединицы КОБ [11-13,15 и др.]. Причем, в отличие от обычных активаторов плазминогена, эта способность КОБ и субъединиц имела ^-период > 4 час [12, 15 и др.].

Таблица 1. - Расщепление фибриновых пластин с инактивированным плазминогеном (мм ² зон лизиса) субъединицами (0,06 М фосфатный буфер, рН 7,4, 37 ^оС, 20 час; п=5)

Примечание - Плазминоген выделен методом аффинной хроматограции из отходов получения у- глобулинов, на пластины наносили 15 мкл субъединиц или 15 мкл субъединиц + 15 млк плазминогена, концентрация белков субъединиц - 0,1 г/мл, плазминогена - 0,2 мг/мл

Таблица 2. - Кинетика лизиса плазминоген-содержащих фибриновых пластин (мм ² зон лизиса) различными активаторами плазминогена (0,06 М фосфатный буфер, рН 7,4, 37 ^оС; и=5)

Примечание - Использованы международный стандарт ВОЗ "Стрептокиназа" и урокиназа фирмы РЯХ, Япония.

Таблица 3. - Влияние олигомера ЧОР и его субъединиц на расщепление плазминоген-содержащих фибриновых пластин активаторами плазминогена (мм ² зон лизиса, 0,06 М фосфатный буфер рН 7,4, 37 °С, 20 часов; и=4)

Примечание - В скобках указана собственная плазминоген-активаторная способность ЧвР и его субъединиц; частично очищенный тканевый активатор плазминогена получен из сердца свинки.

Следует заметить, что в работе [5] наличие плазминоген-активаторной функции у Р- субъединицы отрицалось. Однако авторы не привели концентрацию образца, с которым проводилось исследование. Полученные же нами данные позволяют считать, что таковая у Р-субъединицы лишь на 20% уступала плазминоген-активаторной способности у- субъединицы.

Исследование совместного действия олигомера и его субъединиц с хорошо известными активаторами плазминогена не выявили аддитивности плазминоген-активаторной способности, а в случае а-субъединицы - при смешивании ее со стрептокиназой или урокиназой некоторый тормозящий эффект (1115%) (таблица 3).

Это дало основание для предположения, что молекулы Р- и у-субъединиц, а также олигомера фактора роста нервов не взаимодействуют с использованными активаторами плазминогена.

Примечательно действие а-субъединицы на плазминоген-активаторную способность Р-субъединицы. При температуре 25 °С полное подавление указанной способности наблюдали уже при концентрации а- субъединицы 40 мкг/мл, тогда как при более высокой температуре даже увеличение концентрации а-субъединицы почти на порядок угнетение плазминоген-активаторной способности Р-субъединицы не превышало 40% [12,15] (рисунок 1). На наш взгляд, здесь возможны два варианта развития событий. Либо при более высокой температуре происходит быстрая ассоциация обеих субъединиц, только частично затрагивающая активный сайт Р-субъединицы. Либо Р-субъединица сама обладает все же протеолитической активностью, что ведет к деструкции молекулы а-субъединицы. Выяснение этих возможных путей требовало проведения дальнейших исследований.

Рисунок 1. - Влияние добавок а-субъединицы КОР на плазминоген-активаторную способность Р-субъединицы при 25 °С (1) и при 37 °С (2)

На такую же способность у-субъединицы а-субъединица практически не влияла: 444±17 мм ² в контроле против 454+13 мм ² в опыте (не показано).

Использование группоспецифических ингибиторов протеиназ показало, что фенилме- тилсульфонилфторид умеренно (на 30%) угнетал плазминоген-активаторную способность олигомера NGF, полностью подавляя таковую способность Р-субъединицы и на 84% у у-субъединицы ([12, 17], рисунок 2). Ингибиторное действие р-хлормеркурибензоата на действие Р- субъединицы не превышало 34%, а в случае у-субъединицы вообще не проявлялось. Примечательно также небольшое (на 20-26%) снижение плазминоген-активаторной способности только Р-субъединицы в присутствии реагентов, связывающих металлы [12].