Статья: Эколого-генетические принципы селекции растений на повышение эффективности взаимодействия с микроорганизмами

-- Оценка ферментативных активностей, специфичных для симбиозов. При изучении азотфиксирующих систем в первую очередь следует определять активность нитрогеназы, катализирующей восстановление азота. Хотя этот фермент синтезируется и функционирует в бактериальных клетках, у большинства ризобий его синтез происходит только при симбиозе. В связи с этим нитрогеназная активность клубеньков может с полным основанием считаться признаком бобовых растений, по которому должна проводиться их селекция. Существенное возрастание интенсивности азотфиксации может быть достигнуто за счет отбора бобовых растений на высокую активность клубенько-специфических изоформ ферментов С- и N-обмена (например фосфоенолпируваткарбоксилазы и глутаматсинтазы), участвующих в снабжении бактерий углеродом и в ассимиляции фиксированного азота (6). При функционировании микоризных симбиозов важную роль играют некоторые ферменты углеродного (сукцинатдегидрогеназа) или фосфорного (полифосфатазы) метаболизма, которые в перспективе можно использовать в качестве маркеров при отборе симбиотически активных растений (30).

Для определения нитрогеназной активности при азотфиксирующих симбиозах применяют прямые и косвенные методы. Прямые методы на основе использования нерадиоактивного изотопа ¹⁵N позволяют дать наиболее адекватную оценку количества фиксируемого азота (31). Однако для экспресс-анализа селекционного материала нецелесообразно применение этих дорогостоящих методов. Поэтому широкое распространение получил косвенный метод, основанный на способности нитрогеназы восстанавливать ацетилен до этилена (ацетилен-редуктазная активность -- АРА). Первое время после разработки ацетиленового метода считалось, что он позволяет решать весь комплекс задач, связанных с изучением азотфиксирующих систем, в том числе определять количество фиксируемого азота (32, 33). Позднее выяснилось, что этот метод имеет серьезные ограничения: ацетилен нарушает каталитические свойства нитрогеназы, а также влияет на целостность диффузионного барьера, ограничивающего доступ в клубеньки токсичного для нитрогеназы кислорода (34). Кроме того, метод определения АРА моделирует лишь первую стадию фиксации азота, так как в молекуле С₂Н₂ происходит разрыв только одной из трех связей между атомами углерода.

Несмотря на эти ограничения, метод определения АРА может быть использован при сравнительной оценке большого числа генотипов растений, так как систематические ошибки этого метода нивелируются в ходе сравнения. Особенно удобен метод определения АРА на первых этапах селекции, когда решается задача отбраковки большого числа симбиотически неактивных растений. Эффективность этого подхода показана на примере козлятника восточного сорта Гале, весьма изменчивого по АРА и содержащего менее 10 % растений, обладающих высокой азотфиксирующей активностью (35).

Показана возможность применения метода определения АРА и на последующих этапах селекции при сравнительной оценке симбиотически активных генотипов (11, 14, 15, 36). Однако при этом необходимо иметь в виду, что излишне высокая нитрогеназная активность может приводить к потреблению больших количеств энергии, что отрицательно отражается на продуктивности растений. Ограничивает использование метода определения АРА в селекции симбиотрофных форм и то обстоятельство, что нитрогеназная активность не всегда четко связана с эффективностью симбиоза, определяемой по массе растений. В модельных опытах, проведенных с использованием самофертильных линий люцерны, показано, что АРА коррелирует с массой растений для индивидуальных особей внутри каждой линии (r = 0,55; Р₀ < 0,01), однако при сравнении разных линий достоверная корреляция отсутствует (r = 0,21; Р₀ > 0,05) (37). Следовательно, интенсивность фиксации азота и его использование для формирования биомассы контролируются у растений разными группами генов. Поэтому метод определения АРА наиболее эффективно может применяться в селекции при работе с относительно однородным растительным материалом.

Большой интерес представляет использование в симбиотической селекции биохимических признаков растений. На примере люцерны показано, что повышение симбиотической активности растений может быть обусловлено активацией выделения корнями флавоноидов, играющих ключевую роль в индукции генов вирулентности ризобий (38, 39). Взаимодействие небобовых растений с ризосферными PGPR-бактериями связано с составом выделяемых корнями экссудатов: наибольшая азотфиксирующая и антифунгальная активность PGPR-бактерий проявляется тогда, когда в экссудатах преобладают органические кислоты, являющиеся оптимальными источниками питания и энергии для этих бактерий (28, 40). В связи с этим в селекции растений на повышение активности ризосферных ассоциаций следует учитывать состав корневых экссудатов (41). Важно отметить, что в ходе симбиотической селекции можно существенно улучшить биохимический состав растений, например, у люцерны при активном симбиотрофном питании азотом накопление нитратов снижается, а накопление белка, витаминов и каротина -- возрастает (42, 43).

Улучшение симбиотических признаков бобовых растений

В селекции бобовых растений на повышение эффективности симбиотической азотфиксации может применяться широкий набор методов, включая массовый и индивидуальный отбор, рекуррентную и беккроссную селекцию, а также методы, связанные с использованием доноров и созданием синтетических популяций (18). Выбор используемого метода зависит от биологии размножения растений, а также от особенностей генетического контроля признаков симбиоза.

Наследование симбиотических признаков. Симбиотические свойства бобовых растений контролируются олигогенами, аллельное состояние которых определяет качественное проявление способности к симбиозу (например ключевые стадии морфогенеза клубеньков), и полигенами, детерминирующими количественное проявление симбиотических признаков (число и масса клубеньков, интенсивность фиксации азота, продуктивность симбиотрофно питающихся растений). Наибольшее внимание селекционеров привлекают полигены, то есть исследование количественных признаков симбиотической азотфиксации (12, 44). При гибридизации различных сортов бобовых наследуемость азотфиксирующей активности и числа клубеньков в широком смысле может достигать 0,8-0,9, а в узком смысле -- 0,6-0,8. Для люцерны, сои и инкарнатного клевера (Т. incarnatum) при селекции на симбиотические признаки выявлена высокая реализованная наследуемость (табл. 2).

Эти данные свидетельствуют о том, что отбор бобовых растений по признакам симбиоза может быть весьма результативным. В то же время при селекции необходимо учитывать, что характер наследования симбиотической активности в случае гибридизации контрастно различающихся форм зависит от вида растений и анализируемого признака (18). Так, у сои высокая азотфиксирующая способность является доминантным признаком, а у клевера лугового (T. pratense), люцерны и гороха -- рецессивным или полудоминантным. У клевера подземного (Т. subterraneum) число клубеньков и скорость их образования обусловлены соответственно доминантным и полудоминантным генами.

2. Характер наследуемости симбиотических признаков у растений различных бобовых культур (цит. по 18)

Существенную роль в определении количественных признаков симбиоза играют эффекты гетерозиса. При диаллельных скрещиваниях был выявлен существенный вклад специфической комбинационной способности (СКС) в определении симбиотических признаков, часто превышающий вклад общей комбинационной способности (ОКС). Так, у растений люцерны по нитрогеназной активности и удельному содержанию азота эффекты СКС оказались выше, чем ОКС, а по массе растений, общему содержанию азота и числу клубеньков преобладали эффекты ОКС (45). У растений гороха в определении нитрогеназной активности преобладали эффекты СКС, а массы растений и числа клубеньков -- ОКС (46). Гетерозис позволяет избежать снижения продуктивности, наблюдаемого у перекрестноопыляющихся бобовых (люцерна посевная, клевер луговой) при рекуррентной селекции на высокую нитрогеназную активность (11, 47).

Селекция по признакам клубенькообразования. Одним из первых и наиболее простых этапов получения симбиотически активных растений является отбор по интенсивности образования клубеньков. Так, у растений фасоли в результате двух-трех циклов рекуррентного отбора удалось получить формы, превышающие по числу клубеньков исходные сорта более чем в 2 раза (48). При этом общая масса клубеньков увеличивалась менее чем на 60 %, однако масса одного клубенька уменьшалась на 14-30 %. Аналогичные данные были получены при массовом отборе на повышенную интенсивность клубенькообразования у сои (49). У клевера подземного отбор на увеличение числа клубеньков также сопровождался уменьшением их размеров, в результате чего общий объем клубеньков оставался постоянным (50). Эта закономерность связана с наличием у бобовых мощных систем авторегуляции клубенькообразования, которые лимитируют формирование избытка клубеньков. Однако повышение интенсивности образования клубеньков до определенного предела может быть целесообразным: линии фасоли, отобранные по этому признаку, превосходили исходные сорта по массе семян на 74 %, по содержанию в них белка -- на 27 % (48). У растений гороха между эффективностью симбиотической азотфиксации и числом клубеньков высокая степень корреляции отмечена только у линий с низкой интенсивностью образования клубеньков (51).

При симбиотической селекции бобовых растений необходимо учитывать тот факт, что в полевых условиях растения взаимодействуют не только с производственными, но и с местными штаммами ризобий, которые часто обладают низкой азотфиксирующей активностью, но высокой конкурентоспособностью (52). Со стороны ризобий процесс конкуренции за образование клубеньков контролируется сложным комплексом генов, манипулирование которыми позволяет совмещать в одном штамме высокую азотфиксирующую активность и конкурентоспособность (53). Однако для эффективного решения проблемы конкуренции интродуцированных и местных штаммов ризобий необходимо использовать также и генетически обусловленную предпочтительность растений к заражению определенными штаммами.

Известно, что бобовые растения весьма полиморфны по способности отбирать из смешанного инокулюма эффективные штаммы ризобий. Возможность селекции по признаку предпочтительной заражаемости ризобиями (host preference) была впервые показана для клевера ползучего (Т. repens) (54). У люцерны при селекции на повышение азотфиксации удалось получить формы, обладающие способностью отбирать высокоактивные штаммы ризобий из смеси последних с низкоактивными штаммами (11). У гороха для решения этой задачи был использован метод интрогрессии в высокопродуктивные сорта аллеля sym-2, который определяет устойчивость к штаммам Rhizobium leguminosarum, доминирующим в почвах Европы, однако не препятствует инокуляции штаммами-интродуцентами, содержащими специфический ген вирулентности nodX. В качестве доноров аллеля sym-2 использовали примитивные линии гороха афганского происхождения, в качестве реципиента -- высокопродуктивный и симбиотически активный сорт Норд. После проведения серии беккроссов и отборов на безазотном фоне были выделены линии гороха, устойчивые к заражению почвенными штаммами ризобий, но образующие клубеньки при симбиозе со специально подобранным высокоактивным штаммом Al (nodX⁺). При инокуляции штаммом А1 урожайность семян была более чем на 50 % выше, чем у растений исходного сорта (55, 56). Аналогичный подход можно применить и в селекции сои, у которой выявлена серия генов, ограничивающих инокуляцию неэффективными штаммами Bradyrhizobium japonicum (57).

Селекция по азотфиксирующей активности. Приступая к селекции на повышение азотфиксирующей активности, селекционеры часто задаются вопросом: должны ли они стремиться к полному «переключению» бобовых растений на симбиотрофное питание азотом или необходимо лишь количественное изменение баланса между двумя типами питания? Известно, что максимальная эффективность симбиоза достигается при выращивании растений на обедненных почвах, так как усвоение связанного азота энергетически более выгодно, чем фиксация атмосферного азота, и при внесении нитратов в высоких дозах бобовые часто не образуют клубеньков. У этих растений можно получить формы со значительным преобладанием симбиотрофного типа питания азотом, например суперклубенькообразующие мутанты (Nod⁺⁺) сои или гороха (58, 59). Общая нитрогеназная активность (на одно растение) у этих мутантов обычно бывает повышена, однако специфическая активность (на единицу массы клубеньков) -- понижена. У таких форм часто снижена интенсивность усвоения нитратов, но повышена устойчивость симбиотического аппарата к ингибирующему действию последних, в связи с чем фенотип суперклубенькообразующих мутантов часто обозначают Nts (nitrate tolerant symbiosis). Однако общая продуктивность у Nod⁺⁺Nts-мутантов обычно понижена в связи с перерасходом энергии на образование и функционирование избытка клубеньков (60).