Статья: Дифференциальный анти-ВИЧ-эффект нового препарата на основе гуминовых веществ в различных клетках-мишенях иммунной системы

Оценка жизнеспособности клеток. Жизнеспособность клеток определяли с помощью МТТ-теста, суть которого заключается в измерении способности живых клеток превращать хорошо растворимый желтый бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ) в нерастворимые внутриклеточные кристаллы МТТ-формазана. Эффективность такого превращения отражает общий уровень дегидрогеназной активности клеток и в известных пределах прямо пропорциональна концентрации живых клеток [37]. Согласно принятым критериям высокотоксичными считаются вещества, ТД₅₀ которых составляет от 1 до 10 мкг/мл, токсичными - от 11 до 20 мкг/мл, от 21 до 50 мкг/мл умеренно токсичными, от 51 до 100 мкг/мл - слаботоксичными. Вещества с ТД₅₀ более 100 мкг/мл относят к категории нетоксичных.

Определение анти-ВИЧ-активности. При исследовании антивирусной активности клетки в течение 2 ч инкубировали при 37°С в 96-луноч- ных планшетах (Corning, США) с СБФГ в различных концентрациях (10, 1, 0.1 и 0.01 мкг/мл) и затем заражали вирусом с множественностью инфекции 100 TCID₅₀ (Tissue Culture Infection Dose 50). После инкубации в течение 24 ч несвязавшийся вирус удаляли путем низкоскоростного центрифугирования планшета, а осадок клеток ресуспендировали в свежей ростовой среде. За развитием инфекции наблюдали в течение 5 сут, оценивая цитопатический эффект (цитолиз, образование синцития).

Уровень ингибирования инфекции оценивали методом иммунофер- ментного анализа (ИФА) на основе моноклональных антител к коровому антигену р24 ВИЧ-1. Основной высококонсервативный коровый антиген р24 является признанным маркером ВИЧ-инфекции. В работе мы использовали сертифицированные коммерческие тест-системы Bio-Rad (США) и «Вектор-Бест» (Россия).

Статистическая обработка результатов. Экспериментальные данные получены в трех независимых повторностях, результаты рассчитывали как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM). Значимость различий между выборками оценивали с использованием теста Колмагорова-Смирнова, одностороннего теста ANOVA и поправки Бонферрони (Origin Pro 2016G, OriginLab Corporation) для экспериментов более чем с 2 подгруппами.

Показатели полумаксимальной ингибирующей концентрации (ИД₅₀) и 50% цитотоксической концентрации (ТД₅₀) рассчитывали, исходя из кривых доза-эффект c помощью программ Origin Pro 2016G Softwear и Sigma Plot 12.5 Softwear. Различия считали статистически значимыми при рассчитанной величине р < 0.05.

Результаты и обсуждение

Характеристика химического состава СБФГ. Исследования элементного состава СБФГ выполняли в двух параллельных повторах. Оказалось, что СБФГ - это полиэлементное вещество с повышенным содержанием P и Na (6000 и 10 029 мкг/мл соответственно). Важно отметить практически полное отсутствие тяжелых металлов в исследуемом веществе.

По данным ГХ-МС-анализа в составе СБФГ наиболее представлены жирные и смоляные кислоты.

Среди жирных кислот преобладают гексадекановая, октадеценовая и докозановая кислоты (по 1.2 мкг/г).

В меньшей степени в СБФГ содержатся октадекановая, эйкозановая и тетракозановая кислоты (по 0.4 мкг/г). Среди смоляных кислот в анализируемом образце обнаружены три компонента, относящиеся к ряду C₂₀H₃₀O₂ (1.6 мкг/г), из которых один компонент можно точно отнести к абиетиновой кислоте (0.6 мкг/г). Остальные являются изомерными структурами в пределах данной брутто-формулы. Две другие смоляные кислоты имеют брутто-формулу: C₂₀H₂₈O₂. Наиболее характерный пик на масс- хроматограмме соответствовал дегидролевопимаро- вой кислоте (18 мкг/г).

С помощью ЯМР-спектроскопии фрагментный состав СБФГ был сопоставлен с составом гуминовых кислот угля (табл. 1).

Таблица 1. Фрагментный состав СБФГ

Содержания карбонильных, карбоксильных и сложноэфирных фрагментов в СБФГ сходны с содержанием в гуминовых кислотах угля. Содержание фенольных групп в СБФГ немного выше (11% против 7-9%).

Традиционными являются высокие показатели величины соотношений C_COO-H ^/C_COO-R и C_Ar-OH/ C_Ar-OH, которые отображают степень гидролизованности структуры. Особенностью СБФГ является высокое содержание ароматических фрагментов, при этом ароматическая часть структуры содержит большое количество незамещенных и О-замещенных фрагментов.

Изучение цитотоксических свойств СБФГ. Цитотоксические свойства СБФГ оценивали, культивируя клетки в присутствии различных концентраций этого вещества в течение 3-4 дней, с последующим определением жизнеспособности клеток с помощью МТТ-теста.

Исследование цитотоксичности в трех независимых экспериментах показало, что СБФГ является нетоксичным препаратом, причем как в отношении перевиваемой Т-клеточной линии CEM-SS, так и в отношении первичных клеток (МПК) (табл. 2).

Таблица 2. Антивирусная активность, цитотоксичность и индекс селективности СБФГ в перевиваемых и первичных CD4+ Т-клетках

ИД₅₀ - 50% ингибирующая доза, при которой инфекция подавляется на 50%; ТД₅₀ - цитотоксическая доза, при которой 50% клеток утрачивают жизнеспособность; индекс селективности, рассчитывается как отношение ТД₅₀ к ИД₅₀. Значения R² приведены для ИД₅₀. Представлены средние данные, вычисленные по результатам изучения цитотоксических свойств и антивирусной активности СБФГ в трех независимых экспериментах.

Исследование антивирусной активности СБФГ на перевиваемых и первичных CD4+ Т-клетках, зараженных чувствительным и устойчивым штаммами ВИЧ-1

Результаты определения ингибирования экспериментальной ВИЧ-инфекции свидетельствуют о том, что СБФГ способен эффективно подавлять инфекцию как AZT-чувствительного (HIV-1/BRU), так и AZT-резистентного штаммов вируса (HIV-1/ AR216) и в перевиваемых, и в первичных клетках (табл. 2). При этом для 50% подавления инфекции AZT-чувствительного штамма и в перевиваемых, и в первичных клетках требуется практически одинаковая концентрация препарата - менее 1 мкг/мл.

Ингибирование инфекции AZT-резистентного штамма несколько отличается в разных клеточных культурах: эффективность СБФГ в большей степени проявляется в МПК, тогда как для снижения инфекции на 50% в клетках CEM-SS концентрация должна быть более высокой. Следует также отметить достаточно высокие значения индекса селективности (600-800), характеризующего перспективность исследуемого препарата, при использовании донорских лимфоцитов (МПК). Эта клеточная модель более предпочтительна, чем перевиваемые клеточные культуры. Ограниченное применение МПК в экспериментальных исследованиях обусловлено рядом причин, основными из которых являются отсутствие стандартизации и вероятность индивидуальной устойчивости к ВИЧ-инфекции (во избежание последней мы использовали для заражения смесь МПК от трех серонегативных доноров).

Изучение антивирусных свойств СБФГ в МПК, макрофагах и дендритных клетках

Дальнейшее исследование антивирусной активности СБФГ проводили на клетках МПК, макрофагах (Мф) и дендритных клетках, которые заражали М-тропными штаммами ВИЧ-1: ВИЧ-1/SF-162, ВИЧ-1/Ba-L и ВИЧ-1/QH (табл. 3).

Таблица 3. Ингибирование вирусной репликации в клетках TZM-bl, МПК, макрофагах и дендритных клетках, инфицированных штаммами ВИЧ-1/SF-162, ВИЧ-1/QH0 и ВИЧ-1/Ba-L

*R² приведен для значений ИД₅₀.

Проведенные исследования позволили оценить эффективность СБФГ в пулах разных иммунных клеток и получить данные, свидетельствующие о различной (дифференциальной) эффективности препарата в этих клетках.

Наиболее чувствительной к действию СБФГ оказалась инфекция в макрофагах, зараженных вариантом R5 ВИЧ-1/Ba-L: 90 и 50% ингибирование инфекции наблюдается при достаточно низких концентрациях препарата (табл. 3), тогда как для достижения того же уровня ингибирования инфекции в дендритных клетках, зараженных тем же самым штаммом, требуются в 15-19 раз более высокие концентрации препарата. Как показали наши исследования, подавление инфекции на 90% в МПК, зараженных штаммом SF-162 (фенотип R5), резистентным к нейтрализации антителами, происходит в присутствии 6.0 мкг/мл СБФГ. Следует отметить, что почти такая же концентрация препарата требовалась для 90% ингибирования штаммов ВИЧ-1 фенотипа X4 (табл. 2). Это наблюдение подчеркивает универсальность СБФГ как анти- ВИЧ-агента в отношении вирусов обоих фенотипов (R5 и X4). Однако наши исследования показывают, что встречаются штаммы ВИЧ-1, проявляющие большую устойчивость к действию СБФГ. Так, для ингибирования штамма ВИЧ-1/QH требуется в 10 раз более высокая концентрация СБФГ в клетках МПК. Наиболее вероятным объяснением этого факта может быть наличие геномных различий у разных штаммов и предсуществующих мутаций, обусловленных естественным полиморфизмом ВИЧ-1.

Несмотря на разницу в концентрациях, во всех вирус-клеточных системах при воздействии СБФГ достигается 90% подавление инфекции, что означает защиту существенной части клеток-мишеней, подвергающихся вирусной атаке. Обнаруженные различия в уровне ингибирования инфекции в разных пулах иммунных клеток, не зависящие от фенотипа вируса, говорят, вероятно, о различиях в биодоступности препарата. Неодинаковое проникновение лекарственных препаратов в различные клетки (ткани) - давно известный факт. Следствием этого может быть концентрация препарата, недостаточная (субоптимальная) для ингибирования вируса. Неполное подавление репликации вируса приводит к возникновению условий, благоприятных для селективного отбора резистентных форм. Это необходимо учитывать в доклинических исследованиях новых препаратов и более детально изучать ингибиторы репликации вируса с использованием пулов индивидуальных иммунных клеток, участвующих в патогенезе ВИЧ.

Известно, что при ВИЧ-инфекции наблюдается прогрессирующее уменьшение субпопуляций иммунных клеток, что неизбежно приводит к снижению функций иммунитета, среди которых можно выделить наиболее существенные: антигенпрезентирующую, стимулирующую Т-клеточные пролиферативные реакции, регулирующую выработку антител В-клетками. При этом снижается также скорость обновления клеточных популяций. Механизмы гибели иммунных клеток во время острой и хронической инфекции полностью не установлены, но известно, что они, скорее всего, включают прямое инфицирование, апоптоз и действие ЦТЛ. Наши исследования показали возможность почти полного подавления ВИЧ-инфекции (более 90%) с помощью СБФГ, что означает возможность сохранения функциональности иммунной системы. Очень важным результатом данного исследования является также особенно высокая эффективность СБФГ в ингибировании ВИЧ- инфекции в макрофагах. Макрофаги, как и Т-клетки памяти, служат резервуарами вируса, наличие которых составляет главную причину невозможности полной эрадикации вируса и необходимости пожизненной анти-ВИЧ-терапии.

Известно, что субпопуляция Т-хелперов фенотипа 17 (Th17), продуцирующих интерлейкин-17, наиболее чувствительна к заражению ВИЧ и, как следствие, подвержена быстрому истощению . Интерлейкин-17 играет ключевую роль в поддержании непроницаемости слизистых кишечника. Утрата IL-17 приводит к деструкции слизистого барьера и увеличению транслокации микробов, что, в свою очередь, приводит к ВИЧ-ассоциированной иммунной гиперактивации [40-43]. Новые знания об участии фенотипически различных, значимых для патогенеза ВИЧ-инфекции субпопуляций иммунных клеток, открывают новые возможности для оценки анти-ВИЧ-потенциала новых соединений.