Дифференциальный анти-ВИЧ-эффект нового препарата на основе гуминовых веществ в различных клетках-мишенях иммунной системы
Г. В. Корнилаева, А. Э. Синявин,
A. Schultz, A. Germann, C. Moog,
H. von Briesen, А. С. Тургиев, Э. В. Карамов
Введение
Клетки врожденного иммунитета, такие, как моноциты, макрофаги и дендритные клетки, представляют собой первую линию защиты от патогенов [1-5], и они же являются клетками-мишенями для ВИЧ. Вирусной атаке подвергаются клетки, экспрессирующие мембранные молекулы CD4, CCR5 и CXCR4, находящиеся, в зависимости от пути проникновения инфекции, в слизистых оболочках, в крови или лимфоидных тканях.
Эффективность инфицирования зависит как от уровня экспрессии поверхностных клеточных рецепторов, так и от штамма вируса [6, 7]. На высоком уровне вирус продуцируется главным образом в активированных во время острой инфекции CD4+ Т-лимфоцитах [8]. Но и в покоящихся CD4+ клетках памяти обнаруживается и репликация вируса, и провирусная ДНК в латентно интегрированном или преинтегрированном состоянии [9].
Клетки с интегрированным вирусным геномом представляют часть существующего длительное время резервуара инфекции в организме, где могут сохраняться до 4 лет [9].
Полагают, что покоящиеся CD4+ клетки памяти подвергаются инфицированию в первую очередь и преимущественно R5-фенотипом вируса [10-12], что может быть связано с экспрессией интегрина LFA-1 [13]. Повышенная способность варианта R5 вируса к репликации может также объяснить их преобладание во время острой или первичной инфекции [14].
В патогенетическом процессе ВИЧ-инфекции участвуют также антигенпрезентирующие клетки - макрофаги и дендритные клетки [15-18], обладающие ВИЧ-специфичными рецепторами, способные активно циркулировать в крови и проникать в различные лимфоидные и нелимфоидные ткани.
Дендритные клетки - классические антигенпре- зентирующие клетки с экстраординарной способностью распознавать и процессировать антиген [19]. Незрелые дендритные клетки обладают повышенной способностью к фагоцитозу, тогда как у зрелых клеток увеличена способность продуцировать цитокины. При созревании в дендритных клетках экспрессия рецепторов CCR5 уменьшается, а CXCR4 увеличивается, что может привести к инфицированию вирусами с обоими фенотипами [18].
Известно также, что клетки Лангерганса (дендритные клетки кожи) способны захватывать вирус с помощью лектина С-типа - лангерина, без продукции вируса. иммунный терапевтический антивирусный гумат
При созревании дендритных клеток продукция вируса в них снижается в 10-100 раз по сравнению с продукцией в незрелых клетках [17, 20]. Большинство исследователей считают, что дендритные клетки не являются активными продуцентами вируса, но благодаря высокой способности к миграции их основная роль заключается в доставке вируса от сайтов проникновения к CD4+ Т-клеткам в лимфоидных тканях, что способствует быстрой диссеминации вируса в организме.
Макрофаги также проявляют чувствительность к ВИЧ-инфекции [21, 22]. R5-вирусы, обладающие тропизмом к макрофагам, так же хорошо реплицируются в макрофагах периферической крови, как и в CD4+ лимфоцитах [23].
Способность продуцировать вирус у макрофагов также различается. Часто при инфицировании макрофагов наблюдается низкая интенсивность продукции вируса, который обнаруживается в секвестрированной форме во внутриклеточных вакуолях.
Причина ограничения вирусной репликации может быть обусловлена внутриклеточными механизмами неспецифической защиты. Обычно R5-вирусы не проявляют цитопатогенных свойств, но некоторые изоляты, особенно обнаруживаемые на поздних стадиях заболевания, размножаются в макрофагах до высоких титров и могут проявлять цитопатический эффект [24, 25].
Инфицированные макрофаги погибают преимущественно путем некроза. Весьма важно, что эти клетки, участвующие в патогенетическом процессе, могут служить резервуаром для вируса, недоступного в виду отсутствия активной вирусной репродукции и синтеза вирусспецифических белков ни для антиретровирусной терапии, ни для распознавания цитотоксическими лимфоцитами иммунной системы.
В целом, опубликованные данные свидетельствуют о том, что пермиссивность иммунных клеток по отношению к ВИЧ во многом зависит от стадии созревания/дифференцировки и функциональной поляризации. При этом может меняться и продукция цитокинов, и рецепторный репертуар.
Индуцированное инфекцией истощение пула чувствительных к вирусу иммунных клеток приводит в конечном итоге к негативному влиянию на формирование дальнейшего иммунного ответа.
Современный подход к оценке антивирусной активности каждого нового препарата непременно включает исследования на основных клетках-мишенях, участниках патогенеза ВИЧ-инфекции, таких, как мононуклеары периферической крови, макрофаги, дендритные клетки. Это позволяет получить информацию об эффективности исследуемого вещества в каждой популяции клеток и иметь представление о его возможности влиять на течение патогенетического процесса, и, в конечном итоге, оптимизировать анти-ВИЧ-терапию.
В настоящей работе исследована анти-ВИЧ-активность нового препарата, представляющего собой солюбилизированную бутанольную фракцию гуминовых веществ (СБФГ).
Согласно масс-спектрометрическим данным и элементному анализу, содержание углерода и кислорода (% по массе) в данной фракции составляет порядка 52.7 и 37.1% соответственно при невысоком содержании азота и серы (4.3 и 2.1% соответственно) [26, 27].
Следует отметить, что элементный анализ гуминовых веществ, полученных из одного источника и с использованием одних и тех же методов выделения и фракционирования, дает воспроизводимые значения. Данные ВЭЖХ показывают, что препарат характеризуется достаточно высоким содержанием гидрофобных ароматических фрагментов (74%), что также подтверждено с помощью 13С-ЯМР. Атомное отношение Н/С составляет 0.8, О/С - 0.53 [28-30].
Известно, что гуминовые вещества образуются в результате распада отмерших организмов и составляют один из самых обширных резервуаров органического углерода.
Препараты на основе гуминовых веществ, разработанные и изученные ранее, такие, как, например Олипифат, характеризуются как экологически чистые и безопасные продукты, обладающие многими полезными свойствами. Они стимулируют гемопоэз, проявляют ранозаживляющую, иммуномодулирующую, антиоксидантную, а также противоопухолевую, антибактериальную, противогрибковую и противовирусную активность [31-33].
Экспериментальная часть
Получение препарата. В качестве исходного сырья для получения гумино- вых веществ использовали лигнинсодержащие материалы (твердые остатки переработки растительного сырья).
Материалы подвергали окислительному щелочному гидролизу с последующим отделением жидкой фазы, ее подкислением, отделением полученного осадка, его промывкой и сушкой.
Полученный полупродукт подвергали экстракции этилацетатом. Далее проводили экстракцию полученного осадка н-бутанолом. Для выделения и солюбилизации биологически активных фракций, обладающих противовирусной активностью, сухой остаток после испарения бутанола очищали многократным переосаждением из щелочного раствора добавлением концентрированной соляной кислоты.
Стандартизацию фракций осуществляли по характерным полосам поглощения в инфракрасной области (наличие специфичных полос поглощения в интервале от 2 до 10 мкм) и молекулярно-массовому распределению (максимум в области 7000 Да). Выход целевого продукта - солюбилизированной бутанольной фракции гуминовых веществ (СБФГ) - составлял ~40%.
Физико-химические методы исследования СБФГ
Элементный состав. Образцы исследуемого соединения доводили до полного растворения при нагревании до 80-1000С в 2 мл азотной кислоты с добавлением нескольких капель пероксида водорода в течение 3 ч. Полученный раствор анализировали методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивносвязанной аргоновой плазмой на приборе ICAP-9000 (Thermo Jarrell Ash, США).
ГХ-МС-анализ. Навеску СБФГ доводили до полного воздушно-сухого веса и обрабатывали 5 мл толуола в ультразвуковой бане. Экстракты отфильтровывали, сушили безводным сульфатом натрия и упаривали в токе азота. Часть проб подвергали метилированию. Аликвотную часть образца анализировали с помощью ГХ-МС на комплексе, включающем газовый хроматограф НР5890А, масс-спектрометр НР5988А и систему обработки данных НР59970С (Hewlett-Packard, США). Компоненты пробы идентифицировали с помощью компьютерного поиска и библиотеки масс-спектров Wiley.
ЯМР-спектроскопию выполняли с использованием прибора Bruker Avance 400 MHz NMR.
Клеточные линии. CEM-SS - перевиваемая иммортализованная линия, клонированная из Т4-лимфобластоидной клеточной линии человека путем адгезии с помощью поли-L- лизина, обладающая повышенной способностью к вирус-индуцированному синцитиеобразованию и фузогенной активностью, широко используется для изучения ВИЧ и его ингибиторов (NIH AIDS Reagent Program № 776, США). Клетки культивировали в питательной среде RPMI-1640 (Sigma, США), дополненной 10% фетальной сыворотки (Sigma, США), 2 мM L-глутамина (Sigma, США).
Мононуклеары периферической крови (МПК) выделяли из обработанной антикоагулянтом (EDTA) цельной крови серонегативного донора путем седи- ментационного разделения при центрифугировании в растворе фиколла (GE Healthcare Worldwide, США). Для заражения вирусом использовали стимулированные митогеном МПК, полученные путем 3-4-дневного культивирования с 5 мкг/мл фито-гемагглютинина (ФГА, Sigma, США). Зараженные клетки культивировали в среде RPMI-1640 c 10% фетальной сыворотки, 100 мкг/мл гентамицина и 50 ЕД/ мл рекомбинантного интерлейкина-2 (IL-2, Sigma, США).
Макрофаги (Мф) человека получали путем адгезии моноцитов из пула МПК (концентрация 1-2 X 106 клеток/мл) после 2 ч инкубации при 370С с последующей дифференцировкой клеток в течение 7-8 дней в присутствии 0.2 мкг/мл GM-CSF (Invitrogen, США) в ростовой среде указанного состава.
Дендритные клетки (ДК) получали путем культивирования моноцитов человека в течение 7 дней в присутствии 20 нг/мл интерлейкина-4 (IL-4, Sigma, США) (фракция моноцитов выделена из МПК с помощью MACS (magnetic cell separation system CD14+; Miltenyi Biotec., ФРГ)). Антигенпрезентирующая функция ДК и моноцитов протестирована путем оценки способности стимулировать аллогенную пролиферацию Т-клеток.
TZM-bl - перевиваемая клеточная линия, полученная из клеток HeLa генно-инженерным путем, экспрессирующая CD4, CXCR4, CCR5 и содержащая Tat-зависимый репортерный ген люциферазы под контролем длинных концевых повторов (LTR) ВИЧ-1 (NIH AIDS Reagent Program № 8129, США).
293T/17 - эпителиальные клетки почки человека, полученные из клеточной линии 293Т. Линия 293Т/17 характеризуется высокой способностью к трансфекции и используется для получения высоких титров инфекционных ретровирусов (ATCC® CRL-11268).
Вирусы. Клетки заражали следующими штаммами ВИЧ-1:
ВИЧ-1/BRU - референсный штамм с фенотипом X4, активно реплицирующийся в Т-лимфобластоидных клеточных линиях, чувствительный к действию AZT (азидотимидин).
ВИЧ-1/AR216 - выделенный от ВИЧ-инфицированного пациента клинический изолят X4- фенотипа, адаптированный к Т-клеточным линиям, обладающий высокой устойчивостью к AZT.
ВИЧ-1/Ba-L - М-тропный штамм R5-фенотипа.
ВИЧ-1/SF-162 - М-тропный штамм R5-фенотипа.
ВИЧ-1/QHO - М-тропный штамм R5-фенотипа, выделенный от пациента в Тринидад и Тобаго.
Биологическую активность вирусных стоков оценивали с помощью титрования по TCID50.
Получение env-псевдовирусов ВИЧ-1. Псевдовирусы получали по описанной ранее методике [34]. Клетки 293Т/17 высевали в концентрации 2 X 106 на флакон Т-75 в 20 мл среды DMEM. После инкубации в течение 24 ч клетки трансфицировали 4 мкг плазмиды, экспрессирующей ген env, кодирующий белок оболочки соответствующего подтипа ВИЧ-1, и 8 мкг плазмиды pSG3AEnv без гена env, несущей недостающие гены для сборки псевдовируса ВИЧ-1.
Для трансфекции использовали реагент Fugene 6 (Promega, США). После 4 ч инкубации среду для трансфекции заменяли свежей ростовой средой. Содержащие псевдовирус супернатанты собирали через 48 ч и хранили при -800С. Все плазмиды получены из международного репозитория по программе NIH AIDS Reagent Program.
Антиретровирусный TZM-bl-анализ. Анализ нейтрализации env-псевдовирусов проводили с использованием клеток TZM-bl по методу Montefiori [35] - модифицированной версии Wei и соавт. [36]. Свежие трипсинизированные клетки засевали в 96-луночные планшеты в концентрации 1 X 104 клеток/лунка в 100 мкл среды DMEM с 5 мкг/мл DEAE-декстрана. К клеткам добавляли различные разведения исследуемого соединения и инкубировали в течение 45-90 мин при 37°С. Далее клетки инокулировали 150000 RLU (относительные люминесцентные единицы) соответствующего псевдовируса.
После 48 ч инкубации клетки промывали средой и лизировали, а затем с помощью люминоме- тра Victor X3 (Perkin Elmer) определяли количество люциферазы в сравнении с контролем. Значения 50% ингибирующей концентрации рассчитывали с помощью GraphPad Prism 6 c использованием функции log (ингибитор) в сравнении с нормированным ответом.