Статья: Чувствительность дыхания и набухания митохондрий злаков к соединениям, изменяющим проницаемость мембран

В экспериментах с инкубацией контрольных митохондрий озимой пшеницы с ЦА обнаружили снижение набухания органелл (рис. 6). Так как известно, что накопление ионов Са²⁺ в митохондриях вызывает открытие высокопроницаемых пор [10, 12, 25], было изучено влияние ионов Са²⁺ на набухание митохондрий озимой пшеницы, которые предварительно инкубировались с ЦА и без него. Присутствие ионов Са²⁺ в инкубационной среде стимулировало степень набухания митохондрий (рис. 6). Са²⁺-индуцированное набухание ингибировалось после предварительной инкубации митохондрий с ЦА (рис. 6). Увеличение степени набухания контрольных митохондрий наблюдали и в присутствии пальмитиновой кислоты, действие которой было аналогичным действию ионов Са²⁺ (рис. 6). Вызванное пальмитиновой кислотой набухание было чувствительным к ЦА (рис. 6).

При добавлении к митохондриям КАТ - ингибитора АДФ/АТФ-антипортера - наблюдали снижение набухания (рис. 7), что свидетельствует о том, что в набухании митохондрий озимой пшеницы принимает участие АДФ/АТФ-антипортер. При добавлении БСА, связывающего СЖК, происходило также уменьшение степени набухания митохондрий (рис. 7). В то время как ГДФ - ингибитор растительного разобщающего белка PUMP - не оказывал влияния на набухание митохондрий озимой пшеницы (рис. 7).

ЦА-чувствительная, Са²⁺- и пальмитат-зависимая стимуляция набухания митохондрий озимой пшеницы согласуется с данными, полученными при изучении влияния ЦА, ионов Са²⁺ и пальмитиновой кислоты на дыхание митохондрий озимой пшеницы, которые также выявили ЦА-чувствительный, Са²⁺- и пальмитат-зависимый характер разобщения процессов окисления и фосфорилирования митохондрий. Поскольку набухание митохондрий является одним из показателей открытия высокопроницаемой митохондриальной поры, можно заключить, что наблюдаемое разобщение окислительного фосфорилирования и набухание митохондрий связаны с открытием митохондриальной поры.

Набухание митохондрий из проростков, подвергнутых кратковременному и длительному низкотемпературным воздействиям, было нечувствительно к действию ЦА (см. рис. 6). Инкубация этих митохондрий с ионами Ca²⁺ стимулировала набухание, которое было также ЦА-нечувствительно (см. рис. 6). Индукция набухания митохондрий в присутствии пальмитиновой кислоты была менее выражена, по сравнению с эффектом этой кислоты в митохондриях, изолированных из контрольных проростков. Набухание митохондрий, вызванное действием пальмитиновой кислоты, полностью ингибировалось ЦА (см. рис. 6). При добавлении КАТ и ГДФ к митохондриям, изолированным из проростков, подвергнутых кратковременному холодовому воздействию, происходило снижение набухания (см. рис. 7). Добавление БСА к митохондриям не изменяло степень их набухания (см. рис. 7). Снижение степени набухания митохондрий под действием ингибиторов АДФ/АТФ-антипортера и разобщающего белка PUMP указывает на вклад этих белков в ответ на кратковременное холодовое воздействие. Если в митохондриях контрольных проростков действие ГДФ на набухание отсутствовало, то его влияние на набухание митохондрий из проростков, подвергнутых холодовому стрессу, указывает на важную роль разобщающего белка PUMP в условиях стресса. Отсутствие влияния БСА на набухание митохондрий объясняется увеличением вовремя холодового стресса содержания СЖК и тем, что используемой концентрации БСА оказывается недостаточно для их связывания.

Действие КАТ в митохондриях из закаленных в холоде проростков было аналогичным его эффекту в митохондриях из проростков, подвергнутых кратковременному холодовому воздействию (см. рис. 7). Добавление ГДФ к митохондриям закаленных проростков не изменяло степень их набухания, тогда как БСА снижал степень набухания митохондрий из закаленных проростков (см. рис. 7). Эти данные указывают на то, что при холодовом закаливании в набухании митохондрий озимой пшеницы, обусловленном действием СЖК, принимает участие АДФ/АТФ-антипортер.

Набухание митохондрий из проростков, подвергнутых окислительному стрессу как самому по себе, так и после действия низких температур, так же как и набухание митохондрий из контрольных проростков, ингибировалось ЦА. Присутствие ионов Ca²⁺ и пальмитиновой кислоты не вызывало стимуляции набухания митохондрий. КАТ и БСА вызывали снижение степени набухания, в то время как ГДФ не оказывал влияния (см. рис. 7). Снижение набухания под действием КАТ наряду с действием БСА в митохондриях озимой пшеницы из проростков, подвергнутых действию окислительного стресса, указывает на роль АДФ/АТФ-антипортера в набухании, обусловленном СЖК.

Обсуждение результатов исследования

Митохондрии, являясь одним из центров регуляции энергетического метаболизма, играют ключевую роль в ответе растений на стрессовые воздействия, а также выступают в качестве центральных органелл в процессе ПКГ. Известно, что высокие и низкие температуры и окислительный стресс вызывают изменение проницаемости митохондриальных мембран у животных, связанной с разобщением окислительного фосфорилирования и набухания матрикса митохондрий [26]. Увеличение проницаемости внутренней митохондриальной мембраны за счет разобщения окислительного фосфорилирования и набухания предшествует открытию в митохондриях высокопроницаемой поры, выходу апоптогенных белков и инициации ПКГ [2]. В этих событиях важная роль принадлежит ионам Са²⁺ и СЖК. Способность СЖК вызывать открытие высокопроницаемой поры объясняется их протонофорным действием [5-6] и взаимодействием с АДФ/АТФ-антипортером [7], а также образованием комплекса жирной кислоты и ионов Са²⁺ [4].

Проблема регуляции высокопроницаемой митохондриальной поры находится в центре научного внимания. Существование классической ЦАчувствительной поры в растительных митохондриях до сих пор обсуждается, а данные о влиянии стрессовых факторов на процессы, происходящие при открытии высокопроницаемых пор у растений, малочисленны. Полагают, что высокопроницаемые поры имеют два функциональных состояния: регулируемое состояние, которое активируется ионами Са²⁺ и ингибируется специфическим ингибитором - ЦA и ионами Mg²⁺, и нерегулируемое состояние, которое является Са²⁺-независимым и нечувствительным к ЦA и ионам Mg²⁺ [27].

Этиолированные проростки злаков являются удобной моделью для изучения механизмов старения и естественной, неиндуцированной внешними воздействиями запрограммированной гибели клеток стареющего органа у растений [15]. С использованием в качестве маркеров апоптоза фрагментации ядерной ДНК и изменений на уровне ультраструктурной организации клеток показано, что в колеоптиле этиолированных проростков пшеницы апоптоз происходит на 6-8-й день [15], а в первом листе - на 5-8-й день [24]. В нашей работе было изучено изменение проницаемости митохондриальных мембран злаков в присутствии индукторов и ингибиторов высокопроницаемой поры у этиолированных проростков в возрасте 3 дней.

Изучение влияния ионов Са²⁺, как индукторов, и ЦА, как ингибитора митохондриальной поры, эффект которого выступает диагностическим признаком классической высокопроницаемой поры, на функционирование митохондрий злаков, различающихся по степени холодоустойчивости (озимая рожь, озимая пшеница и кукуруза), позволило установить, что в митохондриях всех изученных растений существует Са²⁺-зависимая и ЦА-чувствительная пора. Однако действие ионов Са²⁺ и ЦА на дыхание митохондрий проростков озимой пшеницы, по сравнению с митохондриями проростков озимой ржи, было более выражено.

На митохондриях животных показана роль пальмитиновой кислоты в апоптозе, связанном с открытием Са²⁺/пальмитат-зависимой поры, нечувствительной к ЦА [4]. Использование в наших экспериментах пальмитиновой кислоты выявило ЦА-чувствительную, Са²⁺- и пальмитат-зависимую стимуляцию скорости нефосфорилирующего дыхания митохондрий озимой пшеницы. Эти данные согласуются с результатами, полученными при изучении влияния ЦА, ионов Са²⁺ и пальмитиновой кислоты на набухание митохондрий озимой пшеницы, которые также имели ЦА-чувствительный, Са²⁺- и пальмитат-зависимый характер. В связи с этим можно сделать вывод, что в митохондриях озимой пшеницы существует Са²⁺/пальмитат-зависимая и ЦАчувствительная пора. Однако способность ЦА ингибировать процессы дыхания и набухания митохондрий исчезала после низкотемпературного воздействия на проростки и появлялась после следующего за низкотемпературным окислительного стресса, что позволяет заключить, что в условиях стресса происходят изменения свойств митохондриальной поры.

Следует заметить, что в отличие от обнаруженной нами чувствительности набухания митохондрий из побегов проростков озимой пшеницы к ЦА Virolainen c соавт. [12] на митохондриях из корней проростков озимой пшеницы показали нечувствительность набухания к данному ингибитору. Можно предполагать, что механизмы индукции и регуляции открытия высокопроницаемой поры в митохондриях зависят даже от функциональной роли того или иного органа растения. Полученные нами данные согласуются с предположением других авторов о нескольких функциональных состояниях высокопроницаемой поры как в митохондриях животных, так и растений [8-12, 27] и указывают на то, что индукция и регуляция митохондриальной поры могут происходить посредством нескольких механизмов.

Известно, что одним из структурных компонентов митохондриальной поры является АДФ/АТФ-антипортер [1-2]. Ингибиторный анализ выявил участие АДФ/АТФ-антипортера при набухании митохондрий озимой пшеницы, изолированных как из контрольных проростков, так и после изученных стрессовых воздействий. Оказалось, что в набухании митохондрий из проростков озимой пшеницы, подвергнутых кратковременному холодовому воздействию, наряду с АДФ/АТФ-антипортером принимает участие разобщающий белок PUMP [28].

Обнаружение в митохондриях злаков Са²⁺-зависимой и ЦА-чувствительной поры и изменения ее свойств при холодовом и окислительном воздействиях значительно расширяет и дополняет имеющиеся знания о процессах, предшествующих инициации программы клеточной гибели в растительной клетке, и открывает перспективы для дальнейших исследований в области изучения ПКГ растений.

злак митохондрия пшеница холодоустойчивость

Литература

1. Crompton M. The Mitochondrial Permeability Transition Pore and Its Role in Cell Death // Biochem. J. 1999. Vol. 341. P. 233-249.

2. Tsujimoto Y., Shimizu S. Role of the Mitochondrial Membrane Permeability Transition in Cell Death // Apoptosis. 2007. Vol. 12, № 5. P. 835-840.

3. Di Paola M., Lorusso M. Interaction of Free Fatty Acids with Mitochondria: Coupling, Uncoupling and Permeability Transition // Biochim. Biophys. Acta. 2006. Vol. 1757. Р. 1330- 1337.

4. Belosludtsev K.N., Saris N.E., Andersson L.C., Belosludtseva N., Agafonov A., Sharma A., Moshkov D.A., Mironova G.D. On the Mechanism of Palmitic Acid-Induced Apoptosis: the Role of a Pore Induced by Palmitic Acid and Ca²⁺ in Mitochondria // J. Bioenerg. Biomembr. 2006. Vol. 38, № 2. P. 113-120.

5. Skulachev V.P. Uncoupling: New Approaches to an Old Problem of Bioenergetics // Biochim. Biophys. Acta. 1998. Vol. 1363. P. 100-124.

6. Wojtczak L., Schonfeld P. Effect of Fatty Acid on Energy Coupling Processes in Mitochondria // Biochim. Biophys. Acta. 1993. Vol. 1183. P. 41-57.

7. Skulachev V.P. Fatty Acid Circuit as a Physiological Mechanism of Uncoupling of Oxidative Phosphorylation // FEBS Lett. 1991. Vol. 294. P. 158-162.

8. Arpagaus S., Rawyler A., Braendle R. Occurrence and Characteristics of the Mitochondrial Permeability Transition in Plants // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277, № 3. P. 1780-1787.

9. Tiwari B.S., Belenghi B., Levine A. Oxidative Stress Increased Respiration and Generation of Reactive Oxygen Species, Resulting in ATP Depletion, Opening of Mitochondrial Permeability Transition, and Programmed Cell Death // Plant Physiol. 2002. Vol. 103. P. 845-854.

10. Fortes F., Castilho R.F., Catisti R., Carnieri E.G.S., Vercesi A.E. Са²⁺ Induces a Cyclosporin A-Insensitive Permeability Transition Pore in Isolated Potato Tuber Mitochondria Mediated by Reactive Oxygen Species // J. Bioenerg. Biomembr. 2001. Vol. 33, № 1. P. 43-51.

11. Curtis M.J., Wolpert T.J. The Oat Mitochondrial Permeability Transition and Its Implication in Victorin Binding and Induced Cell Death // Plant J. 2002. Vol. 29, № 3. P. 295-312.

12. Virolainen E., Blokhina O., Fagerstedt K. Ca²⁺-Induced High Amplitude Swelling and Cytochrome c Release from Wheat (Triticum aestivum L.) Mitochondria under Anoxic Stress // Ann. Bot. 2002. Vol. 90. P. 509-516.

13. Balk J., Leaver C.J., McCabe P.F. Translocation of Cytochrome c from the Mitochondria to the Cytosol Occurs during Heat-Induced Programmed Cell Death in Cucumber Plants // FEBS Lett. 1999. Vol. 463. P. 151-154.

14. Koukalova B., Kovarik A., Fajkus J., Siroky J. Chromatin Fragmentation Associated with Apoptotic Changes in Tobacco Cells Exposed to Cold Stress // FEBS Lett. 1997. Vol. 414. P. 289-292.

15. Кирнос М.Д., Александрушкина Н.И., Шорнинг Б.Ю., Кудряшова И.Б., Ванюшин Б.Ф. Межнуклеосомная фрагментация и синтез ДНК в проростках пшеницы // Физиология растений. 1999. Т. 46. С. 48-57.

16. Войников В.К. К вопросу о выделении интактных растительных митохондрий // Известия Сибирского отделения АН СССР. Сер. биол. наук. 1980. Т. 10, вып. 2. С. 121-125.

17. Побежимова Т.П., Грабельных О.И., Колесниченко А.В., Сумина О.Н., Войников В.К. Локализация белков, иммунохимически родственных субъединицам стрессового белка 310 кД, в митохондриях озимой пшеницы // Физиология растений. 2001. Т. 48. С. 238-244.

18. Tolbert N.E. Isolation of Sub-Cellular Organelles of Metabolism on Isopicnic Sucrose Gradients // Methods Enzymol. 1974. Vol. 31. P. 734-746.

19. Трушанов А.А. Изготовление в лабораторных условиях закрытого полярографического электрода Кларка // Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом / Отв. ред. Г.М. Франк. М.: Наука, 1973. 221 с.

20. Estabrook R.W. Mitochondrial Respiratory Control and the Polarographic Measurement of ADP: O Ratio // Methods Enzymol. 1967. Vol. 10. P. 41-47.

21. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein Measurement with Folin Phenol Reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265-275.

22. Laemmli U.K. Cleavage of Structural Proteins during the Assemble of the Head Bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227, № 5259. P. 680-685.

23. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. М.: Наука, 1989. 564 с.

24. Замятнина В.А., Бакеева Л.Е., Александрушкина Н.И., Ванюшин Б.Ф. Апоптоз в первом листе у этиолированных проростков пшеницы: влияние антиоксиданта ионола (ВНТ) и перекисей // Биохимия. 2002. Т. 67, вып. 2. С. 253-264.

25. Hansson M.J., Persson T., Friberg H., Keep M.F., Rees A., Wieloch T., Elmer E. Powerful Cyclosporin Inhibition of Calcium-Induced Permeability Transition in Brain Mitochondria // Brain Research. 2003. Vol. 960. Р. 99-111.

26. Kaasik A., Safiulina D., Zharkovsky A., Veksler V. Regulation of Mitochondrial Matrix Volume // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2007. Vol. 292. Р. 157-163.

27. He L., Lemasters J.J. Regulated and Unregulated Mitochondrial Permeability Transition Pores: a New Paradigm of Pore Structure and Function // FEBS Lett. 2002. Vol. 512. P. 1-7.

28. Murayama S., Handa H. Isolation and Characterization of cDNAs Encoding Mitochondrial Uncoupling Proteins in Wheat: Wheat UCP-genes are not Regulated by Low Temperature // Mol. Gen. Genet. 2000. Vol. 264. P. 112-118.