Статья: Чувствительность дыхания и набухания митохондрий злаков к соединениям, изменяющим проницаемость мембран

128 Н.С. Павловская, О.И. Грабельных, Т.П. Побежимова

Чувствительность дыхания и набухания митохондрий 119

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ДЫХАНИЯ И НАБУХАНИЯ МИТОХОНДРИЙ ЗЛАКОВ К СОЕДИНЕНИЯМ, ИЗМЕНЯЮЩИМ ПРОНИЦАЕМОСТЬ МЕМБРАН

Н.С. Павловская, О.И. Грабельных, Т.П. Побежимова, Н.А. Королёва, В.К. Войников

Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН (г. Иркутск)

Аннотация

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке программы Президиума РАН «Биоразнообразие и динамика генофондов» (подпрограмма «Динамика генофондов»), грантов Президента РФ для государственной поддержки ведущих научных школ РФ (НШ-4812.2006.4) и поддержки молодых российских ученых (МК-1876.2007.4), РФФИ (грант № 07-04-01055), Междисциплинарного интеграционного проекта СО РАН № 47, молодежного проекта СО РАН № 115 и Фонда содействия отечественной науке.

Изучено влияние ионов кальция, пальмитиновой кислоты, циклоспорина А, карбоксиатрактилозида, ГДФ и БСА на функционирование митохондрий злаков, различающихся по степени холодоустойчивости. Показано, что в митохондриях изученных злаков существует Са²⁺-зависимая и циклоспорин А-чувствительная пора. Установлено, что кратковременная и длительная холодовые обработки проростков озимой пшеницы приводят к снижению чувствительности процессов дыхания и набухания изолированных из них митохондрий к циклоспорину А, которая вновь проявляется после следующего за низкотемпературным окислительного воздействия, что позволяет предположить изменение свойств митохондриальной поры в условиях стресса. В набухании митохондрий озимой пшеницы как в нормальных, так и в стрессовых условиях принимает участие АДФ/АТФ-антипортер. Кратковременное холодовое воздействие приводит к повышению вклада в набухание митохондрий озимой пшеницы разобщающих белков, что обусловлено увеличением содержания в митохондриях СЖК. Установлено, что в митохондриях озимой пшеницы высокопроницаемая Са²⁺-зависимая и циклоспорин А-чувствительная пора является пальмитат-зависимой.

Ключевые слова: митохондрии; дыхание; набухание; разобщение окислительного фосфорилирования; высокопроницаемая митохондриальная пора.

Annotation

Natalie S. Pavlovskaya, Olga I. Grabelnych, Tamara P. Pobezhimova, Nina A. Koroleva, Viktor K. Voinikov

Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry of Russian Academy of Sciences, Irkutsk, Russia

SENSITIVITY OF RESPIRATION AND SWELLING OF CEREALS MITOCHONDRIA TO MODIFYING PERMEABILITY OF MITOCHONDRIAL MEMBRANES COMPOUNDS

The aim of the given investigation was to study the influence of compounds modifying permeability of mitochondrial membranes on the functioning of cereals mitochondria differing in the extent of cold resistance. It is shown that Са²⁺-dependent and CsA-sensitive pore exist in mitochondria of studied cereals. It is determined that short-term and long cold treatments of winter wheat seedlings lead to a decrease in sensitivity of respiration and swelling of isolated mitochondria to CsA that shows again after oxidative stress following cold stress. This fact allows supposing the change of mitochondrial pore properties under stress conditions. ADP/ATP antiporter takes part in swelling mitochondria from winter wheat both in normal and in stress conditions. The short-term cold treatment leads to an increase in contribution of uncoupling proteins to swelling mitochondria from winter wheat that is caused by increasing content of FFA in mitochondria. It is determined that in winter wheat mitochondria Са²⁺-dependent and CsA-sensitive pore is palmitate-dependent.

Key words: mitochondria; respiration; swelling; uncoupling of oxidative phosphorylation; рermeability transition pore.

В последнее время изменение проницаемости митохондриальных мембран привлекает большое внимание в связи с тем, что разобщение окислительного фосфорилирования и набухание матрикса митохондрий являются событиями, предшествующими открытию в митохондриях высокопроницаемой поры (от англ. рermeability transition pore), высвобождению цитохрома с и инициации программированной клеточной гибели (ПКГ) [1, 2]. Вовлеченность митохондрий в ПКГ как у животных, так и у растений не вызывает сомнений. Ведущую роль в изменении проницаемости митохондриальных мембран играют ионы Са^2+, увеличение содержания которых в матриксе приводит к их взаимодействию со свободными жирными кислотами (СЖК) и индукции набухания органелл, открытию поры и индукции ПКГ [3, 4]. Способность жирных кислот вызывать открытие высокопроницаемой поры объясняется как их протонофорным действием [5, 6], так и непосредственным взаимодействием с АДФ/АТФ-антипортером [7]. Механизм индукции митохондриальной поры у растений изучен мало. Существование классической поры в растительных митохондриях, чувствительной к циклоспорину А (ЦА), до сих пор обсуждается, а данные о влиянии стрессовых факторов на процессы, происходящие при открытии высокопроницаемых пор у растений и приводящие к клеточной гибели, фрагментарны. В митохондриях растений обнаружены как чувствительные к ЦА высокопроницаемые поры [8, 9], так и нечувствительные [10-12].

Установлено, что окислительный стресс, вызванный обработкой Н₂О₂, является причиной выхода цитохрома с в цитозоль в клетках арабидопсиса [9]. ПКГ, индуцированная тепловым шоком, в растениях огурца [13] и аноксия озимой пшеницы [12] также приводят к высвобождению цитохрома с из митохондрий этих растений. Показано, что холодовой стресс служит стимулом для активации ПКГ в культуре клеток табака BY-2, который приводит к специфической фрагментации хроматина, сопряженной с апоптическими изменениями ядра и цитоплазмы [14]. В то же время отсутствуют данные о влиянии холодового воздействия на изменение проницаемости мембран митохондрий растений. Этиолированные проростки злаков представляют удобную модель для изучения изменения проницаемости митохондриальных мембран, поскольку колеоптиль и первый лист злаков в процессе онтогенеза претерпевает ПКГ [15].

Целью настоящей работы явилось изучение влияния соединений, изменяющих проницаемость митохондриальных мембран, на функционирование митохондрий злаков, различающихся по степени холодоустойчивости.

Материалы и методы исследования

В работе использовали 3-дневные этиолированные побеги проростков озимой пшеницы (Triticum aestivum L., сорт Иркутская озимая), озимой ржи (Secale cereale L., сорт Чулпан), кукурузы (Zea mays L., сорт Российская 1), выращенные на влажной фильтровальной бумаге при 26єС. Всхожесть семян составляла 92-95,0%.

Растительный материал подвергали кратковременной холодовой обработке (-4єС, 1 ч), холодовому закаливанию (4єС, 7 сут), окислительному стрессу (0,5 мМ Н₂0₂, 4 ч), а также сочетанию кратковременной холодовой обработки с последующим окислительным стрессом и холодового закаливания с последующим окислительным стрессом.

Митохондрии выделяли с помощью дифференциального центрифугирования [16]. Очистку органелл проводили модифицированным методом в ступенчатом градиенте перколла, состоящем из 18, 23, 35% перколла [17]. Целостность наружной мембраны очищенных митохондрий определяли по активности цитохром с оксидазы (ЕС 1.9.3.1) [18] в отсутствии и присутствии 0,04% Тритона Х-100.

Активность митохондрий регистрировали полярографически с платиновым электродом закрытого типа (электрод Кларка) в ячейке объемом 1,4 мл [19] на полярографе ОН-105 (Венгрия) при температуре 26-27єС. Реакционная среда для определения активности митохондрий содержала 18 мМ КН₂РО₄ (рН 7,4), 125 мМ КСl, 1 мМ МgСl₂ в присутствии 5 мМ ЭДТА или в его отсутствии. Использовали следующие субстраты окисления: 10 мМ малат+10 мМ глутамат, 8 мМ сукцинат+5 мМ глутамат и 1 мМ НАДН.

Полярограммы были использованы для расчёта скоростей фосфорилирующего (состояние 3, V3) и нефосфорилирующего (состояние 4, V4) дыхания, коэффициента дыхательного контроля по Чансу-Вильямсу и отношения АДФ:О [20]. Скорости дыхания в состояниях 3 и 4 выражали в нмоль О₂/(мин·мг митохондриального белка). Концентрацию митохондриального белка определяли в соответствии с методом Lowry с соавт. [21].

Набухание выделенных митохондрий измеряли спектрофотометрически при длине волны 540 нм на приборе СФ-26 (Россия). Измерение проводили в аэрируемой среде в кюветах объемом 2 мл при температуре 26єС. Среда для набухания содержала 200 мM KCl и 20 мM MOPS (pH 7,4). О набухании судили по падению оптической плотности митохондриальной суспензии (ОП₅₄₀), данные рассчитывали в виде разницы оптической плотности (ДОП₅₄₀), равной (ОПt₀-ОПt₁)?100, где ОПt₀ - начальная оптическая плотность, ОПt₁ - оптическая плотность через определенное время.

В качестве индукторов митохондриальной поры применяли ионы Ca²⁺ (в составе CaCl₂) (1,75 мМ) и пальмитиновую кислоту (50 мкМ). В качестве соединений, изменяющих проницаемость митохондриальных мембран, использовали ЦА (1 мкМ) - специфичный ингибитор митохондриальной поры, карбоксиатрактилозид (КАТ) (1 мкМ) - ингибитор АДФ/АТФ-антипортера, ГДФ (1 мМ) - ингибитор растительного разобщающего белка PUMP и 0,5%-ный бычий сывороточный альбумин (БСА), связывающий СЖК. Инкубацию с ионами Ca²⁺ и ЦА проводили при температуре 0єС в течение 5 мин.

Электрофорез белков в ПААГе с ДДС-Na проводили в блоках полиакриламидного геля в модифицированной системе Лэммли [22], используя прибор для электрофореза Mini-PROTEAN III Electrophoretic Cell фирмы BIO-RAD (США). Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану («Sigma», США) проводили в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя. Определение молекулярных масс полипептидов проводили, используя в качестве стандартов набор белков («Sigma», США).

Все опыты проведены в 3-6 биологических повторностях. На рис. 1-7 указаны средние значения и их стандартные отклонения.

Результаты исследования

ЭДТА является одним из постоянных компонентов среды выделения митохондрий. Он выполняет защитную функцию, т.к. является комплексообразователем, связывающим ионы Са²⁺, которые освобождаются при разрушении ткани. Для изучения влияния ионов Са²⁺ и ЦА на скорость нефосфорилирующего дыхания митохондрий разных видов растений, отличающихся по степени холодоустойчивости (озимая рожь, озимая пшеница и кукуруза), необходимо было проверить, как влияет исключение ЭДТА из сред промывания, ресуспендирования и инкубации на чувствительность митохондрий к указанным реагентам.

О влиянии индукторов и ингибиторов митохондриальной поры на функционирование митохондрий озимой пшеницы судили по их действию на скорость нефосфорилирующего дыхания (состояние 4, V4). Это связано с тем, что в основе механизма разобщения окислительного фосфорилирования лежит рост скорости дыхания в присутствии субстратов и в отсутствии АДФ [23].

Митохондрии злаков, изолированные и инкубируемые в средах, содержащих ЭДТА, были нечувствительны к действию ЦА (рис. 1). Это позволяет предположить, что на всех уровнях изоляции митохондрий происходит связывание ионов Са²⁺, что является причиной отсутствия существенного влияния ЦА на скорость нефосфорилирующего дыхания.

В то же время ЦА ингибировал нефосфорилирующее дыхание митохондрий, изолированных в средах с добавлением ЭДТА, но инкубируемых в его отсутствии (рис. 2). Присутствие в инкубационной среде ионов Ca²⁺ приводило к увеличению скорости нефосфорилирующего дыхания при окислении митохондриями малата и НАДН, т.е. ионы Ca²⁺ в этих условиях являлись разобщающими агентами (рис. 2). Эта чувствительность была наибольшей в митохондриях озимой пшеницы и кукурузы (рис. 2). Са²⁺-вызванная стимуляция скорости нефосфорилирующего дыхания ингибировалась добавлением ЦА при окислении малата и НАДН (рис. 2).

В митохондриях, выделенных и инкубируемых в средах, не содержащих ЭДТА, происходило увеличение скорости нефосфорилирующего дыхания в присутствии ионов Са²⁺ при окислении всех используемых субстратов дыхания, которое было ЦА-чувствительно (рис. 3).

Таким образом, действие специфичного ингибитора митохондриальной поры - ЦА - и ионов Са²⁺ - индукторов поры - наблюдали у митохондрий всех изученных злаков как выделенных и инкубируемых в отсутствии ЭДТА, так и у митохондрий, только инкубируемых без ЭДТА. Полученные в работе данные позволяют говорить о существовании в митохондриях из этиолированных проростков озимой пшеницы, озимой ржи и кукурузы регулируемой Са²⁺-зависимой и ЦА-чувствительной поры.

Этиолированные проростки злаков являются удобной моделью для изучения механизмов ПКГ стареющего органа у растений. Показано, что в колеоптиле этиолированных проростков озимой пшеницы апоптоз происходит на 6- 8-й день [15], а в первом листе - на 5-8-й день [24]. Поскольку процесс клеточной гибели является генетически запрограммированным, то интересно было изучить изменение проницаемости митохондриальных мембран в присутствии индукторов и ингибиторов высокопроницаемой поры на более ранних этапах развития проростков озимой пшеницы (в возрасте 3 дней).

Изучение интактности наружной мембраны митохондрий, изолированных из проростков, не подвергнутых действию стрессовых факторов, и из проростков, подвергнутых низкотемпературному и окислительному воздействиям, показало ее высокие значения (от 94-99,0%). На хорошую сохранность изолированных митохондрий также указывают данные иммуноблоттинга митохондриальных белков с антителами к цитохрому с. Во всех препаратах митохондрий обнаружено присутствие белка с мол. массой около 18 кД, в то время как в цитоплазматической фракции цитохрома с не обнаружено (рис. 4).

Дыхание митохондрий из контрольных проростков озимой пшеницы оказалось чувствительным к индукторам (ионы Ca²⁺ и пальмитиновая кислота) и ингибитору (ЦА) митохондриальной поры (рис. 5), что позволило предположить функционирование Са²⁺/пальмитат-зависимой и ЦА-чувствительной поры в митохондриях этих проростков.

В то же время кратковременное и длительное холодовые воздействия на проростки озимой пшеницы изменяли чувствительность выделенных из них митохондрий к ЦА (рис. 5). Присутствие в инкубационной среде митохондрий ионов Ca²⁺ приводило к увеличению скорости нефосфорилирующего дыхания (рис. 5). Однако наблюдаемое увеличение не ингибировалось ЦА (рис. 5). Пальмитиновая кислота вызывала стимуляцию скорости нефосфорилирующего дыхания, которое было ЦА-чувствительно (рис. 5). Следующий за низкотемпературным окислительный стресс, вызываемый обработкой проростков озимой пшеницы перекисью водорода, приводил к появлению чувствительности дыхания митохондрий к ЦА (рис. 5).