Каждый фермент катализирует не любое превращение субстрата, а какое либо одно - специфичность пути превращения. Например, на АК ГИС действуют 2 фермента: гистидаза (отщепляет NH3) и гистидиндекарбоксилаза (отщепляет CO2).
Выделяют несколько видов специфичности:
а) абсолютная специфичность. Фермент действует только на один единственный субстрат. Пр.: уреаза разрушает мочевину: NH2-CO-NH2 (над стрелкой уреаза, под - вода) 2NH3+ CO2. Аргиназа катализирует распад аргинина.
б) групповая специфичность. Фермент действует на определённую связь в разных субстратах. Пр.: пептидазы разрывают пептидные связи [-NH-CH(R)-CO--NH-CH(R)-CO-]. Пепсин действует только на связи, образованные карбоксильной группой ароматических АК (ФЕН, ТИР, ТРИ). Эстеразы разрывают сложно-эфирную связь [-CO-NH-] в различных липидах. Гликозидазы действуют на гликозидную связь. Действие ферментов, обладающих групповой специфичностью, позволяет организму содержать небольшое количество ферментов.
в) стереоспецифичность. Фермент действует на определённый стереоизомер (D- и L-, цис- и транс-). Пр.: бутен-2-диовая кислота имеет 2 стереоизомера: транс-изомер или фумаровая к-та, и цис-изомер или малеиновая кислота.
Фумараза действует на фумаровую к-ту с превращением последней в яблочную.
В стереоспецифичности выделяют оптическую специфичность - избирательное действие ферментов на оптические изомеры. Например, под действием ЛДГ разрушается только L-форма молочной к-ты.
3) Влияние температуры (правило Вант-Гоффа). При увеличении температуры на 10 градусов скорость реакции увеличивается в 1,5-2 раза. Но для фермента это правило действует только до 40 градусов, т.к. дальше наступает тепловая денатурация фермента. Большинство ферментов в организме человека имеет оптимальную температуру 25-40 градусов [рис. графика: по оси х - температура, по у - процент активности. Рисуем горочку, оптимум - на 37-40°С].
Повышение активности фермента при увеличении температуры объясняется увеличением кинетической энергии реагирующих молекул, что приводит к увеличению числа столкновений между молекулами. При дальнейшем повышении температуры энергия становится чрезмерной, и внутри молекулы разрываются слабые связи - водородные, гидрофильные взаимодействия; происходит нарушение вторичной, третичной, четвертичной структуры фермента.
Ряд ферментов термостабильны, например, гликопротеины.
4) Влияние рН. Для поддержания третичной или четвертичной структуры фермента часто может быть необходимо наличие заряда на группе, удаленной от области связывания субстрата. Если же заряд этой группы меняется, то может происходить частичное развертывание белковой цепи, или компактизация, или диссоциация (олигомерные белки). Поэтому при отклонении рН от оптимального значения, фермент может потерять свою нативную структуру, в результате чего не происходит полноценного связывания активного центра с субстратом. Также при изменении рН может происходить изменение заряда на субстрате.
[рис. график. По х - рН, по у - процент активности. Рисуем горочку.]
Пепсин - 1.5-2, амилаза слюны - 6.8-7.2, трипсин - 7.5-8.6. Для большинства ферментов оптимум рН лежит в среде, близкой к нейтральной.
5) Скорость ферментативной реакции прямо пропорциональна кол-ву фермента (для небиологических катализаторов такой зависимости нет). Недостаток фермента в живом организме, например при неполноценном питании, генетических нарушениях, приводит к уменьшению скорости превращения веществ и наоборот.
6) Ферменты являются регулируемыми катализаторами. Так под действием различных веществ (активаторов и ингибиторов) меняется скорость ферментативной реакции.
Классификация и номенклатура ферментов
Согласно международной классификации, принятой в 1961 году, все ферменты делятся на 6 классов по типу катализируемой реакции. Каждый класс делится на несколько подклассов. Классы:
1. оксидоредуктазы;
2. трансферазы;
3. гидралазы;
4. лиазы;
5. изомеразы;
6. лигазы (синтетазы).
1. Оксидредуктазы - ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции. Известно 480 этих ферментов, которые делятся на 17 подклассов.
а) аэробные дегидрогеназы (оксидазы). Отщепляют водород от субстрата и переносят его на молекулу кислорода. Пр.: НАДФН2+О2= Н2О2+НАДФ.
Если кислород непосредственно внедряется в субстрат, то ферменты - оксигеназы. Наибольшее значение имеют оксидазы аминокислот.
б) анаэробные дегидрогеназы - катализируют перенос водорода от субстрата на любой другой акцептор, кроме кислорода.
CH3CH2OH > СН3СН=О
[над стрелочкой алкоголь-ДГ; под стрелочкой НАД > НАДН2 ; этанол превращается в этаналь]
в) цитохромы - это ферменты, переносящие электроны.
г) пероксидазы - гемсодержащие оксидоредуктазы. Они отщепляют водород от субстрата и переносят его на Н2О2.
Пр.: каталазная реакция
2Н2О2 > 2Н2О+О2 [над стрелочкой - каталаза].
2. Трансферазы - ферменты, переносящие группы атомов от одного субстрата к другому. При этом один субстрат донор, а другой - акцептор. В зависимости от природы переносимых групп трансферазы делят на 8 подклассов:
- аминотрансферазы, переносят NH2;
- метилтрансферазы, переносят CH3;
- фосфотрансферазы, переносят PO3H2;
- ацилтрнсферазы.
Пр. переаминирование. [рис. Аланин + альфакетоглутаровая кислота под действием АлАТ и перидоксальфосфата получается ПВК и глутаминовая к-та].
3. Гидролазы - ферменты, катализирующие разрыв одинарных связей с участием воды, присоединяемой по месту разрыва связи. Т.е. они принимают участие в реакциях гидролиза. Все ферменты пищеварительного тракта относятся к гидролазам. Всего выделяют 460 гидролаз. В зависимости от типа разрываемых связей выделяют 11 подклассов:
- эстеразы - разрывают сложно-эфирную связь. Пр.: триацилглицерид+ 3H2O=(липаза) глицерин+ 3С17H35COOH [рис. этого. Стрелочкой показать сложноэфирные связи]
- пептидазы - разрывают пептидную связь. Пр.: АЛА-ГЛИ+ H2O = (дипептидаза) АЛА+ГЛИ [рис. этого. Стрелочкой показать пептидную связь]
- гликозидазы - разрывают гликозидные связи. Пр.: мальтоза+ H2O=(мальтаза) 2глюкозы [рис. этого. Стрелочкой показать гликозидную связь]
4) Лиазы. Эти ферменты осуществляют разрыв углеродных связей без участия воды. Выделяют:
- декарбоксилазы - катализируют отщепление CO2. Пр.:
- альдолазы - катализируют расщепление связи между атомами углерода. Пр.: фруктозо-1,6-дифосфат (6 атомов С)= (альдолаза) фосфоглицериновый альдегид (3 атома С)+ дигидроксиацетонфосфат (3 атома С).
- гидратазы - разрыв двойной связи с присоединением воды по месту разрыва двойной связи.
- ферменты, отщепляющие воду - реакция дегидратации. При этом образуется двойная связь.
5) Изомеразы - ферменты, катализирующие реакции изомеризации и обеспечивающие внутримолекулярную перестройку.
6) Лигазы (синтетазы) - катализируют образование более сложных веществ из более простых. При этом требуется энергия из вне. Обязательно участие АТФ или других трифосфатов (УТФ, ЦТФ и т.д.). [Пр. Аспарагиновая к-та + аммиак + АТФ под действием аспарагинсинтетазы превращается в аспарагин + АМФ + неорганический фосфат +энергия].
Номенклатура ферментов
1) Существует тривиальная номенклатура - названия случайные, без системы и основания, например трипсин, пепсин, химотрипсин.
2) Рабочая номенклатура - название фермента составляется из названия субстрата или продукта реакции, типа катализируемой реакции и окончание -аза, например лактатдегирогеназа.
3) Систематическая, научная - L-лактат-НАД-оксидредуктаза.
4) Все ферменты имеют цифровой шифр, например ЛДГ - 1.1.1.27.
Первая цифра говорит о типе катализируемой реакции, указывая на номер класса.
Вторая уточняет действие фермента - номер подкласса.
Третья указывает природу разрываемой связи в молекуле субстрата - подподкласс.
Четвёртая - порядковый номер фермента.
Современные представления о ферментативном катализе
Первая теория ферментативного катализа была выдвинута в начале 20 века Варбургом и Бейлисом. Эта теория предлагала считать, что фермент адсорбирует на себе субстрат, и называлась адсорбционной, но развития она не получила.
В основу современной теории положена теория Михаэлеса и Ментена. Ведущую роль в механизме ферментативного катализа играет образование фермент-субстратного комплекса. По этой теории весь процесс катализа можно разделить на 3 этапа:
[рис. E+SESES*ES**EPE+P]
1 этап: образование фермент-субстратного комплекса (на рис. до ES включительно). Происходит диффузия субстрата к ферменту и субстрат, в соответствии с принципом комплиментарности, связывается с активным центром фермента - образуется фермент-субстратный комплекс. Реагенты связаны слабыми связями, т.е. водородными, ионными, гидрофобными, в некоторых случаях и ковалентными. Эта стадия непродолжительна, зависит от концентрации субстрата и от скорости диффузии его к активному центру. Энергия активации исходных веществ при этом изменяется незначительно. На этой стадии проявляется эффект концентрирования субстрата на поверхности фермента - эффект ориентации.
2 этап: (на рис. от ES до EP включительно) происходит последовательное преобразование первичного фермент-субстратного комплекса в 1 или несколько активированных. Эта стадия наиболее медленна, ее длительность зависит от величины энергии активации данной реакции. В эту стадию происходит разрыв старых связей и образование новых, при этом энергия активации значительно снижается. По продолжительности эта стадия является лимитирующей для всего процесса.
На этой стадии проявляется эффект вынужденного соответствия - эффект «дыбы»: субстрат под действием фермента претерпевает изменения, делающие его более доступным для воздействия каталитического участка активного центра фермента. Одновременно с этим происходит изменение конформации фермента в большей степени в активном центре.
3 этап: отделение продуктов от активного центра фермента и диффузия их в окружающую среду. Эта стадия непродолжительна, ее скорость определяется скоростью диффузии продуктов в окружающую среду.
[график: по оси х - ход реакции, по у - энергия активации; рисуем горизонтальную прямую от середины оси у, затем горочку и окускаемся ниже прямой, пририсовываем меньшую горочку пунктиром]
Молекулярные эффекты действия ферментов
1) Эффект концентрирования - это адсорбирование на поверхности молекулы фермента молекул реагирующих веществ, т.е. субстрата, что приводит к их лучшему взаимодействию. Пр.: электростатическое притяжение - скорость реакции может возрасти в 103 раз.
2) Эффект ориентации - это специфическое связывание субстрата с контактными участками активного центра фермента, которое обеспечивает взаимную ориентацию молекул субстрата и их сближение для более выгодного воздействия каталитических групп в активном центре. За счет эффекта ориентации скорость реакции возрастает в 103-104 раз. [рис. эффекта ориентации: поворот двух кругов вырезами друг к другу]
3) Эффект натяжения (теория «дыбы»). Субстрат до присоединения к ферменту находится в расслабленной конформации, а после связывания с ферментом деформируется или растягивается. Места деформации легче атакуются каталитическим центром фермента. [рис. эффекта дыбы: субстрат растягивается над ферментом]
4) Эффект вынужденного соответствия (прилегания). Не только субстрат претерпевает изменение конформации, но и фермент, особенно в активном центре, после связывания субстрата меняет свою конформацию, которая становится более комплементарной субстрату.
Теория Фишера: фермент подходит к субстрату как ключ к замку.
Теория Котланда: фермент и субстрат взаимодействуют между собой по принципу рука-перчатка. Истинная комплементарность фермента к субстрату достигается после изменения конформации и субстрата и фермента.
Теория кислотно-основного катализа
В составе активного центра фермента имеются как кислые, так и основные функциональные группы. В результате этого фермент проявляет в ходе катализа кислотно-основные свойства, т.е. играет как роль донора, так и роль акцептора протонов. Кислотно-основной катализ характерен для гидролаз, лиаз, изомераз.
При закреплении субстрата в активном центре на его молекулу влияют электрофильные и нуклеофильные группы каталитического участка, что вызывает перераспределение электронной плотности в субстрате. Такое перераспределение облегчает перестройку и разрыв связей в молекуле субстрата.
Пр.: Реакция превращения ацетилхолина в холин. На первом этапе между СОО- глутамина и N ацетилхолина возникает ионная связь, и возникает фермент-субстратный комплекс. Начинается вторая стадия.
После образования фермент-субстратного комплекса в действие вступают остальные аминокислоты, остатки активного центра. Между углеродом С=О группы ацетилхолина и кислородом ОН-группы серина возникает взаимодействие, т.е. возникает водородная связь между кислородом ацетилхолина и ОН-группы тирозина - эффект «дыбы».
Затем гистидин оттягивает протоны от ОН-группы серина. Вследствие этого упрочняется сложноэфирная связь между серином и остатком уксусной кислоты. Одновременно происходит разрыв другой сложноэфирной связи в молекуле ацетилхолина и переход протона от тирозина к остатку холина.
На третьем этапе холин высвобождается из активного центра. Его место занимает вода. Эта вода располагается между карбонильным кислородом ацетильной группы и кислородом тирозина. Фермент освобождён от продуктов реакции и готов к следующему циклу. На первом и последнем этапе продолжительность этапа зависит от скорости диффузии субстрата к ферменту или от фермента соответственно. Вторая стадия очень часто является лимитирующей весь процесс. Именно на этой стадии происходит снижение энергии активации реагирующих веществ.