Автореферат: Биохимические механизмы влияния полихлорированных бифенилов на морфофункциональное состояние сперматогенеза в экспериментальных условиях

В лизате сперматозоидов также постепенно падали под действием возрастающих доз ПХБ активности АлТ, АсТ и ЩФ. В целом выявленные сдвиги биохимического статуса сперматозоидов указывают на глубокое нарушение клеточного метаболизма сперматозоидов, в частности нуклеинового, белкового и энергетического обменов.

Рисунок 8. Динамика ферментативной активности аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, лактатдегидрогеназы и щелочной фосфатазы в эякуляте крыс при субхронической интоксикации «Соволом» (в % к контролю)

Таблица 2 - Содержание общего белка, альбумина и мочевой кислоты в эякуляте крыс на 30-й и 60-й дни субхронической интоксикации «Соволом» в различных дозах, n=10

Уровень основных энергетических субстратов сперматозоидов - фруктозы и глюкозы менялся по-разному. В условиях воздействия высоких доз бифенилов их содержание в сперматозоидах крыс снижалось до 74,7% и 26,6% по отношению к контрольным значениям соответственно. Это сопровождалось снижением активности одного из ферментов гликолиза - лактатдегидрогеназы (рис.8).

Таблица 3 - Содержание ТБК-РП в семенниках и эякуляте крыс при субхронической интоксикации «Соволом» в различных дозах (мкмоль/г ткани, n=10)

Окислительный стресс как типовой патохимический феномен лежит в основе самых различных патологических процессов, в том числе, при широком круге заболеваний мужской половой системы [Меньщикова Е.Б., 2008; Aitken T., 1998; Agarwal A., 2006]. Изучение содержания продуктов ПОЛ, отражающих интенсивность липопероксидации, показало увеличение концентрации ТБК-РП как в семенниках, так и в эякуляте (табл.3).

Одновременное определение уровня отдельных компонентов и ферментов, участвующих в нейтрализации свободных радикалов, следует, что пероральное введение «Совола» приводит к развитию резкого дисбаланса между прооксидативными процессами и антиокислительными возможностями как в тестикулярной ткани, так и в эякуляте (рис.9,10).

Рисунок 9. Влияние субхронической интоксикации «Соволом» на содержание аскорбата, токоферола, глутатиона восстановленного (ГВ) и свободных сульфгидрильных групп (ССГ) в семенниках и эякуляте крыс (в % к контролю)

Рисунок 10. Активность ГПО, ГТ, ГР, ГГТ в семенниках и эякуляте крыс на 60-й день субхронической интоксикации «Соволом» в различных дозах (в % к контролю)

Воздействие токсиканта по мере увеличения дозы и длительности приводит в итоге к резкому увеличению содержания вторичных продуктов липопероксидации, снижению общей антиокислительной активности, уменьшению концентрации витаминов С, Е, ГВ, ССГ, угнетению СОД, каталазы, ГПО, ГТ, ГР и ГГТ

В то же время при детальном изучении развития этих сдвигов выявляются некоторые характерные отличия в целом соответствующие общебиологическим закономерностям. Антиоксиданты (АО) прямого действия содержатся в эякуляте в значительно меньших количествах по сравнению с тестикулярной тканью, а уровень активности антиоксидантных ферментов заметно ниже. Как следствие, эякулят обладает менее мощными антиокислительными ресурсами, чем яички и признаки развития окислительного стресса в нем появляются раньше и при меньшей интенсивности воздействия ксенобиотика. Эти особенности объясняют и бульшую устойчивость клеточных систем гонад к токсиканту, тогда как морфометрические и, особенно, функциональные характеристики мужских гамет ухудшаются в самые ранние сроки наблюдения. Кроме того, в гомогенатах яичек крыс, подвергшихся отравлению «Соволом» в дозе 5 мг/кг*сут в течение 30 дней было зафиксировано достоверное увеличение активностей каталазы и ГПО (рис.11), чего не наблюдалось в эякуляте.

Эти отличительные особенности, безусловно, закономерны, поскольку антиоксидантная система половой клетки является в значительной степени редуцированной в сравнении с клетками сперматогенного эпителия гонад. При этом сперматозоиды весьма подвержены атакам свободных радикалов в силу особенно высокого содержания в составе плазматических мембран полиненасыщенных жирных кислот, что обусловлено спецификой биологической роли гамет.

Рисунок 11. Активность глутатионпероксидазы и каталазы в семенниках и эякуляте крыс на 30-й день субхронической интоксикации «Соволом» в различных дозах (в % к контролю)

Важным источником АО прямого действия и ферментов обезвреживания свободных радикалов для спермы являются антиоксиданты, содержащиеся в секрете добавочных половых желез и, особенно, эпидидимиса, снабжающего эякулят особой уникальной изоформой ГПО 5-го типа. Однако, функциональные активности семенных пузырьков, вентральной простаты и эпидидимиса в условиях отравления бифенилами также снижаются, что влечет за собой более глубокий дефицит антиоксидантных ресурсов спермы экспериментальных животных и развитие окислительного стресса. В основе его развития при интоксикации ПХБ может лежать AhR-опосредованная активация экспрессии генов семейства цитохромов CYP1A1, 1A2, способных генерировать АФК в процессе окисления, эндогенных и экзогенных субстратов (в т.ч. низкохлорированные ПХБ) [Safe S., 1995; Twarovski L.W., 2001]. Образующиеся при этом моно- и дигидроксильные метаболиты могут спонтанно, либо ферментативно окисляться до семихинонов и хинонов [McLean M.R., 2000]. АФК могут также формироваться при дальнейших окислительно-восстановительных превращениях ПХБ-хинонов. Наконец, ПХБ могут реагировать с H₂O₂ с образованием наиболее реакционно способного гидроксил-радикала [Murugesan P., 2007]. Активированные кислородные метаболиты способны атаковать молекулы липидов, ДНК, белков и, в меньшей степени, углеводов, что приводит к инактивации и потере нативных функций соответствующих биологически активных соединений [Зенков Н.К., 2001; Ланкин В.З., 2005; Дубинина В.А., 2006; Меньщикова Е.Б., 2008; Arunakaran P., 2008].

Корреляционный анализ результатов исследования отдельных показателей крыс-самцов, подвергшихся максимальной токсической экспозиции - 10 мг/кг*сут смеси «Совол» в течение 2-х месяцев. Проведенный непараметрический анализ по Спирмену спермограммы, сперматограммы и биохимических параметров семенников выявил, что уровень конечных продуктов липопероксидации связан обратной связью с общей концентрацией сперматозоидов в эякуляте (r=-0,9151; р=0,0002), относительным содержанием в тестикулярной ткани сперматогоний (r=-0,6986; р=0,02426), сперматоцитов (r=-0,6945; р=0,0258), сперматид поздних (r=-0,7012; р=0,0238), клеток Сертоли (r=-0,6504; р=0,0417) и Лейдига (r=-0,6994; р=0,0243). Эти статистические данные подтверждают высказанные нами ранее предположения о ведущей роли активации пероксидативных процессов в патогенезе репротоксического действия полихлорированных бифенилов. Тесная положительная связь (r=0,9057; р=0,0003) выявлена между концентрацией ТБК-РП в семенниках и долей неподвижных гамет в эякуляте экспериментальных животных. И напротив, обнаружена обратная зависимость относительного содержания спермиев, лишенных какой-либо двигательной активности от уровня как антиоксидантов прямого действия - восстановленного глутатиона (r=-0,6443; р=0,0443), аскорбата (r=-0,6322; р=0,0498), б-токоферола (r=-0,7902; р=0,0065), так и ферментной природы - СОД (r=-0,6930; р=0,0262), каталазы (r=-0,7720; р=0,0088), ГПО (r=-0,6626; р=0,0368), ГТ (r=-0,7112; р=0,0210).

С величиной тканевой концентрации аскорбиновой кислоты, необходимой в процессе стероидогенеза, взаимосвязаны содержание в тестикулярной ткани клеток Лейдига (r=0,7976; р=0,0057), сывороточные уровни синтезируемого ими тестостерона (r=0,8545; р=0,0016) и стимулирующего их функциональную активность лютеинизирующего гормона (r=0,7212; р=0,0185). Количество клеток Лейдига, в свою очередь, тесно коррелировало с содержанием в крови тестостерона (r=0,7976; р=0,0057), ЛГ (r=0,7362; р=0,0151) и эстрадиола (r=0,6564; р=0,0392) и активностью СОД (r=0,7792; р=0,0078), ГПО (r=0,7239; р=0,0179) и уровнем ГВ (r=0,8282; р=0,0030).

Уровень ФСГ оказался связанным прямой корреляцией с общей концентрацией сперматозоидов в эякуляте, со всеми изученными показателями антиоксидантной системы тестикулярной ткани, с содержанием в ней сперматогоний, сперматоцитов, клеток Сертоли. Отрицательная связь выявлена между уровнем ФСГ в крови и долей неподвижных мужских половых клеток (r=-0,9240; р=0,0001).

В семенниках крыс, подвергшихся в течение 60 суток интоксикации ПХБ в ежесуточной дозе 10 мг/кг уменьшение содержания клеток Сертоли коррелировало со снижением продуцируемого ими ингибина В (r=0,8997; р=0,0003), что в совокупности с другими сведениями свидетельствует о нарушениях обратной связи в системе гипофизарного контроля тестикулярных функций и является косвенным подтверждением прямого поражения ткани гипофиза при отравлении ПХБ. Тесно также связан со всеми изучаемыми показателями уровень тестостерона, что является абсолютно закономерным фактом и доказывает важность дисгормональных сдвигов при интоксикации ПХБ в развитии субфертильности крыс-самцов.

Другим параметром с большим количеством сильных корреляционных связей с показателями морфофункционального состояния сперматогенеза и гормонального статуса оказался ГВ. Его тестикулярная концентрация сильно коррелирует с общей концентрацией и долей неподвижных сперматозоидов (r=0,8424; р=0,0022), (r=-0,6443; р=0,0443) соответственно, содержанием в ткани семенников сперматоцитов, клеток Сертоли, клеток Лейдига, сывороточными уровнями тестостерона, эстрадиола, ФСГ, ЛГ, ингибина В. Все это позволяет прийти к выводу, что механизмы поддержания межорганного оборота и регенерации восстановленного глутатиона, занимающего центральное место в антиоксидантной системе, имеют важнейшее значение для адекватного функционирования мужской репродуктивной системы в норме и определяет глубину адаптационных резервов тканей к воздействию агрессивных внешних факторов и, прежде всего, ксенобиотков. Наличие тесных корреляционных взаимосвязей между уровнем отдельных компонентов антиоксидантной системы, оксидантного статуса и большинством морфофункциональных параметров репродуктивной системы экспериментальных животных при действии ПХБ указывает на то, что патогенетической основой развития субфертильности является интенсификация свободнорадикальных процессов в тканях мужской половой системы самцов.

Таким образом, сопоставление результатов экспериментального исследования влияния субхронической интоксикации ПХБ на репродуктивный статус самцов, гормональный профиль, различные морфофункциональные и биохимические параметры тестикул и эякулята, позволяют прийти к заключению о том, что негативное действие ксенобиотиков данного класса на мужскую половую систему опосредовано цитотоксическими эффектами поллютантов, патохимической основой которых является развитие окислительного стресса в мужских гаметах и тканях, где происходит их образование, созревание и осуществляется их высокоспециализированная биологической функции переноса генетической информации для самовоспроизведения, как конечной цели существования вида.

Выводы

1. Длительное отравление крыс полихлорированными бифенилами в суммарных дозах 0,05 ЛД₅₀ и 0,1 ЛД₅₀ приводит к выраженному угнетению оплодотворяющей способности самцов in vivo, достигающего при двухмесячном поступлении «Совола» в дозе 10 мг/кг*сут пятикратного снижения количества успешных исходов беременностей интактных самок. При этом наблюдается значительное уменьшение общей численности потомства, полученного от самцов, подвергшихся воздействию ксенобиотика. Поступление ПХБ в организм самцов оказывает влияние на гендерный состав их потомства: в условиях низкой токсической нагрузки превалируют новорожденные мужского пола и, наоборот, при длительной интоксикации ПХБ в большей дозе (10 мг/кг*сут) - особи женского пола.