Автореферат: Биохимические механизмы влияния полихлорированных бифенилов на морфофункциональное состояние сперматогенеза в экспериментальных условиях

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 21 работа, из них 5 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертаций.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа представлена на 148 страницах печатного текста, иллюстрирована 30 рисунками, содержит 24 таблицы и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных данных, заключения, выводов и списка литературы, включающего 59 отечественных и 211 иностранных источников.

Содержание работы

Материал и методы исследования. Экспериментальные исследования выполнены на 250 белых беспородных крысах-самцах половозрелого возраста массой 180-220г. Животные содержались в одинаковых условиях, на стандартной диете в виварии. Эксперименты выполнены в соответствии с этическими нормами и рекомендациями о гуманном отношении к лабораторным животным, изложенными в Хельсинской декларации и «Правилах проведения работ с использованием экспериментальных животных» [Касаткина Т.Б. , 2000].

Интоксикацию вызывали воздействием отечественной смеси ПХБ «Совол», включающей 26% тетра-, 64,6% пента-, 9% гексахлорбифенилов и следовые количества гептахлорбифенилов. Токсикант вводили внутрижелудочно в растворе оливкового масла с помощью специального металлического зонда один раз в сутки в течение 30 и 60 суток.

Самцы крыс были разделены на 6 групп. Животные 2-й и 5-й групп подвергались интоксикации в ежесуточной дозе 5 мг/кг веса тела в течение 30-и и 60-и дней соответственно. Самцы из 3-й и 6-й групп получали токсикант в количестве 10 мг/кг*сут на протяжении 30-и и 60-и дней соответственно. Таким образом, суммарная токсическая экспозиция крыс 5-й и 6-й групп составляла 0,05 LD₅₀ (300 мг/кг) и 0,1 LD₅₀ (600 мг/кг), установленных для «Совола». Крысам контрольных групп вводили оливковое масло в тех же объемах - по 1,0 мл: 1-й группе - в течение 30 дней, 4-й группе - в течение 60 дней.

На 15-е, 30-е, 45-е и 60-е сутки интоксикаци у крыс получали эякулят путем трансректальной электростимуляции семенного бугорка через слизистую прямой кишки [Рыжаков Д.И, 1980].

Оценку оплодотворяющей способности проводили по стандартной методике in vivo. Для этого животных, подвергшихся интоксикации, помещали в одну клетку с интактными самками (1 самца к двум самкам). Через неделю самок отсаживали. После родоразрешения производили подсчет потомства и определяли долю самцов в каждом помете.

По ходу эксперимента животных групп 2 и 3 умерщвляли под легким эфирным наркозом путем декапитации на 30-й день, а животных групп 5 и 6 - на 60-й день эксперимента, извлекали для исследования семенники, эпидидимис, семенные пузырьки и вентральную простату. Последующие процедуры подготовки тканей осуществляли на холоду.

Для решения поставленных задач при морфометрическом исследовании тестикулярной ткани проводили подсчет сперматогоний, сперматоцитов, сперматид ранних и поздних, а также сперматозоидов [Кузнецова С.В., 2006].

В сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) содержание тестостерона, эстрадиола, лютеинизирующего гормона, фолликулостимулирующего гормона с использованием стандартных тест-систем производства «DRG Diagnostics» (Германия), концентрацию ингибина В - с применением тест-системы производства фирмы DSL (США).

В тканях акцессорных органов исследовали содержание фруктозы по методике Mann (1964), активности нейтральной гликозидазы и кислой фосфатазы - колориметрическим методом [Paquin R., 1984]

В эякуляте и гомогенате семенников определяли содержание глутатиона восстановленного (ГВ) [Гаврилова А.Н., 1986; Карпищенко А.И., 1997], свободных сульфгидрильных групп (ССГ) [Bellomo G., 1990], аскорбата [Omaye S.T. et al., 1971], токоферола [Desai I.D., 1984], активности глутатионпероксидазы (ГПО) [Гаврилова А.Н., 1986], глутатионредуктазы (ГР) [Carlberg I., 1974], глутатион-S-трансферазы (ГТ) [Habig W.H., 1973], гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ) [Orlowski M., 1965], каталазы [Королюк М.А., 1988] и супероксиддисмутазы (СОД) - с помощью набора реактивов RANSOD (Randox Labor Ltd.).

Содержание соединений, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-РП), и общую антиокислительную активность (ОАА) изучали с использованием диагностических наборов производства ООО «Агат-Мед» (Россия) и по Клебанову Г.И. (1988) соответственно.

С помощью биохимического автоматического анализатора «Sapphir-400» в лизате сперматозоидов определяли содержание общего белка, альбумина, мочевой кислоты, фруктозы, глюкозы, активности аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, лактатдегидрогеназы и щелочной фосфатазы.

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета Statistica 6,0 фирмы StatSoft. В группах выборки оценивали следующие параметры: значения медианы, нижний и верхний квартили. Оценку достоверности различий осуществляли с использованием непараметрического критерия (U) Манна-Уитни с поправкой Бонферонни. Корреляционный анализ полученных в эксперименте данных проводили по Спирмену.

Результаты исследования и их обсуждение. Эксперименты по спариванию животных выявили заметное уменьшение численности самок, принесших приплод, после спаривания с самцами, получавшими токсикант. Причем гипофертильный эффект ПХБ проявлялся как при воздействии малых и больших доз, так и спустя 30 и 60 дней интоксикации. С учетом того, что срок формирования сперматозоидов составляет у грызунов около 40 дней можно предположить, что исследуемые токсиканты могут оказывать негативное влияние на оплодотворяющую способность самцов и на посттестикулярном уровне, на что указывают результаты тридцатидневного эксперимента, и на уровне собственно яичек, о чем свидетельствуют итоги двухмесячного отравления (рис.1).

Рисунок 1. Индекс фертильности и индекс плодовитости самцов крыс, подвергшихся отравлению «Соволом» (в % к контролю)

*здесь и далее - р<0,05 в сравнении с группой контроля.

Зафиксировано значительное падение общей численности потомства, полученного от подвергшихся отравлению «Соволом» самцов, достигающее при максимальной токсической нагрузке 34,8% от количества крысят в помете группы сравнения. Важно, что степень снижения данного параметра зависела от интенсивности и сроков отравления, поскольку зарегистрированы статистически значимые отличия между группами самцов, получавших одинаковую дозу в течение 30-и либо 60-и дней, а также между теми, кто получил ту же суммарную дозу полихлорбифенилов (0,05 ЛД₅₀), но за различный промежуток времени.

Другим интересным наблюдением оказалось достоверное увеличение доли мужского потомства до 57,7% самцов, получавших токсикант по 5 мг/кг*сут в течение 30 дней, и ее снижение до 40,0% при определении гендерного баланса помета от самцов, подвергшихся длительному воздействию поллютанта в большей дозе (рис.2).

Рисунок 2. Доля самцов в приплоде крыс, родившихся от экспонированнных «Соволом» крыс в дозах 5 и 10 мг/кг*сут (в % к контролю)

Динамическое изучение параметров эякулята этих животных, получаемого нами через каждые 15 дней наблюдения, показало, что тенденция к уменьшению общего содержания гамет в единице объема спермы обнаруживается уже в ранние сроки наблюдения, а по истечению 45 и 60 суток интоксикации концентрация сперматозоидов статистически значимо снижается независимо от суточных дозировок (рис.3). Это является одной из причин выявленного в условиях субхронического отравления ПХБ угнетения оплодотворяющей способности самцов in vivo.

Рисунок 3. Общая концентрация сперматозоидов в эякуляте крыс при субхронической интоксикации «Соволом» в дозах 5 и 10 мг/кг*сут (в % к контролю)

Угнетение оплодотворяющей способности зафиксировано и при воздействии поллютанта в течение месяца, когда количественные показатели спермограммы не отличались от контроля.

Рисунок 4. Доли сперматозоидов крыс по подвижности при ежедневной интоксикации «Соволом» в дозе 10 мг/кг (в % к контролю)

Однако анализ качественных характеристик эякулята выявил грубые нарушения двигательной активности спермиев в эти сроки наблюдения. Уже к 15-му дню отравления относительное содержание сперматозоидов с поступательной двигательной активностью достоверно снижалось до 55,2% против контрольного значения 68,8%, а после двух месяцев воздействия ПХБ мужских гамет, способных к активному движению in vitro, не выявлялось (рис.4). Сопоставление этих данных приводит к выводу о том, что ПХБ обладают прямыми спермотоксическими свойствами, то есть в механизмы реализации их действия вовлечены посттестикулярные эффекты. В целом эти данные согласуются с результатами других исследователей, использовавших в своих работах иные промышленные смеси ПХБ [Абдуллина Г.М., 2009; Murugesan P. et al., 2007].

Рисунок 5. Содержание сперматогоний, сперматоцитов, сперматид ранних, сперматид поздних и сперматозоидов в семенниках крыс, подвергшихся субхронической интоксикации «Соволом» в дозе 10 мг/кг*сут на 60-е сутки (в % к контролю)

Обнаруженное ухудшение количественных параметров эякулята крыс в условиях интоксикации ПХБ побудило нас подвергнуть изучению тестикулы для морфометрической оценки состояния сперматогенеза. Согласно данным, полученным в ходе исследования мазков тестикулярной ткани, пероральное поступление ПХБ, особенно, длительное и в больших дозах приводит к заметному статистически значимому снижению содержания сперматогоний, сперматоцитов, сперматид и собственно сперматозоидов (рис.5).

Кроме того, по истечению двухмесячной интоксикации «Соволом» зафиксировано значительное уменьшение количества клеток Сертоли, называемых буквально в зарубежной литературе «няньками» сперматогенеза [Griswold M.D., 1995], и клеток Лейдига, отвечающих за синтез андрогенов (табл.1). Это свидетельствует о цитотоксическом действии «Совола» как на родоначальные клетки спермопоэза, клетки всех этапов дифференцировки мужских гамет, так и на процессы стероидогенеза.

Выявленное в последующем в образцах крови этих животных падение уровня половых стероидов, очевидно, нужно признать следствием токсического поражения эндокриноцитов тестикулярной ткани крыс.

Таблица 1 - Содержание клеток Сертоли и клеток Лейдига в семенниках крыс, подвергшихся субхронической интоксикации «Соволом» в суточных дозах 5 и 10 мг/кг, n=10

При этом выраженная гипотестостеронемия обнаруживалась у всех животных, подвергшихся воздействию «Совола» в любых дозах. Сниженная сывороточная концентрация эстрадиола в отличие от андрогена выявлялась лишь в конечной точке наблюдения - на 60-е сутки экспериментального отравления полихлорбифенилами в обеих дозах (рис.6).

Рисунок 6. Содержание гормонов в сыворотке крови самцов крыс на 30-й и 60-дни субхронической интоксикации при воздействии «Совола» в различных дозах (в % к контролю)

Кратковременное воздействие ПХБ сопровождалось заметным подъемом уровня ингибина В, основным продуцентом которого являются клетки Сертоли. Увеличение дозы и длительности воздействия ПХБ приводило к падению этого гликопротеина. Сывороточные уровни ФСГ и ЛГ в крови крыс с гипотестостерон- и гипоингибинемией, против ожидания, не возрастали, а, либо, в ранние сроки интоксикации малыми дозами не отличались от уровня контроля, либо заметно падали с увеличением дозы токсиканта или длительности его воздействия. Согласно результатам, полученным в условиях применимой нами модели интоксикации, имеются основания полагать, что первоосновой отсутствия реакции гипофиза на падение уровня гормонов тестикулярного происхождения является более глубокое повреждение хлорбифенилами клеток, продуцирующих гонадотропины.

Обнаруженное резкое снижение содержания в семенных пузырьках фруктозы, активностей нейтральной б-гликозидазы в эпидидимисе и кислой фосфатазы в вентральной простате (рис.7) однозначно указывают на серьезное поражение тканей указанных органов, участвующих в сохранении и созревании сперматозоидов и образовании эякулята в момент семяизвержения. Выявленные количественные сдвиги свидетельствуют о глубоком нарушении метаболического статуса этих органов, что вероятно является следствием как ослабления андрогенной стимуляции, так и прямым токсическим действием ПХБ. В литературе имеются сообщения о накоплении последних в тканях репродуктивной системы [Andric S.A., 2004]. Особенно в высоких концентрациях бифенилы аккумулируются тканями эпидидимиса [Абдуллина А.З., 2009], богатого содержанием липидов.

Рисунок 7. Содержание фруктозы в семенных пузырьках, активности гликозидазы в эпидидимисе и кислой фосфатазы в простате крыс на 30-й и 60-й день субхронической интоксикации «Соволом» в различных дозах (в % к контролю)

Биохимический анализ лизата отмытых сперматозоидов выявил существенное влияние ПХБ на ряд отдельных параметров. Наиболее заметные сдвиги обнаружены в отношении общего белка и альбумина, уровень которых заметно снижался в условиях высокой токсической экспозиции. Концентрация мочевой кислоты, напротив, с увеличением токсической нагрузки, возрастала до 1,5 раз, что, вероятно, объясняется усилением процессов катаболизма нуклеиновых кислот и пуриновых нуклеотидов (табл.2).