Полученные нами данные о влиянии некоторых полисахаридов (декстрин, крахмал) на выход бактерицидного вещества согласуются с первыми работами, проводимыми с бактериями B. circulans [20]. Сведений об эффективности целлюлоз в отношении синтеза антимикробных пептидов в доступной литературе не обнаружено. Имеются публикации о способности бацилл этой группы вырабатывать ферменты, расщепляющие сложные полисахариды [21] и даже гербициды [22] вне связи с продукцией антимикробных веществ. В целом же вопрос о питательных потребностях штаммов-продуцентов для микробного синтеза бактериоцинов / бактериоциноподобных веществ, остается по-прежнему неясным. По мнению некоторых исследователей [1, 9, 10], для активной продукции этих веществ есть смысл использовать бедные по азоту среды, так как в этом случае создаются лучшие условия для их наработки, что дает возможность бактериям конкурировать с другими в общей экологической нише. Эта точку зрения подтверждают и наши данные (табл.1). По всей видимости, такая закономерность может касаться и других веществ подобного рода [23].
Известна связь биосинтеза пептидных антибиотиков типа полимиксина и бутирозина со спорообразованием продуцентов [24]. По этой причине продуценты этих антибиотиков обычно культивируют в течение 3-5 сут. По нашим данным, бактерицидное вещество штамма B. circulans Ск2ч накапливается в КЖ еще до появления спор. Результаты белкового электрофореза свидетельствуют о том, что величина молекулярной массы антимикробной субстанции Ск2ч составляет 5-6 кДа (рис.2), тогда как у антибиотиков из группы полимиксинов - около 1 кДа [8, 9, 25, 26]. В то же время полученное бактерицидное вещество по величине молекулярной массы более соответствует бактериоцинам класса II лактобактерий [27, 28], но отличается от них более широким спектром антимикробного действия.
Выбранный нами способ извлечения бактериоцидного вещества из супернатанта при помощи неполярного растворителя дихлорметана отличается простотой и эффективностью. Интерфазная пленка, собираемая на границе раздела фаз, содержит более 90% целевого продукта (см. табл.5,6). Ранее описанный способ выделения бактериоцинов был основан на использовании хлороформа [29], который обладает сильным наркотическим действием.
Заключение
Таким образом, установлено, что для глубинного культивирования штамма B. circulans Ск2ч и накопления бактериоциноподобного вещества могут быть использованы простые среды, включающие минеральные источники азота, дрожжевой экстракт, соли, а в качестве источника углерода - олиго - или полисахариды. При выделении бактериоциноподобного вещества из культуральной жидкости целесообразно использовать метод двухфазного разделения с применением наиболее безопасного дихлорметана. Бактериоциноподобное вещество Ск2ч, обладающее широким спектром антимикробного действия, имеет по данным ДСН ПААГ-электрофореза молекулярную массу около 6 кДа, что отличает его от известных антибиотиков.
Литература
1. Abriouel H., Franz C. M., Omar N. B., Galvez A. Diversity and applications of Bacillus bacteriocins // FEMS Microbiology Reviews. 2011. Vol.35. P. 201-232.
2. Babasaki K., Takao T., Shimonishi Y., Kurahashi K. Subtilosin A, a new antibiotic peptide produced by Bacillus subtilis 168: isolation, structural analysis, and biogenesis // J. Biochemistry. 1985. Vol.98. P.585-603.
3. Das P., Mukherjee S., Sen R. Antimicrobial potential of a lipopeptide biosurfactant derived from a marine Bacillus circulans // J. Applied Microbiology. 2008. Vol.104, № 6. P.1675 - 1684.
4. Gharai-Fathabad E. Biosurfactants in pharmaceutical industry: a mini-review // American Journal of Drug Discovery and Development. 2011. Vol.1 (1). P.58-69.
5. Perez C., Suarez C., Castro G. R. Antimicrobial activity determined in strains of Bacillus circulans clusters // Folia Microbiologica. 1993. Vol.38 (1). P.25-28.
6. Pat.3856939 USA. Antibiotic-49/Murao S., Meyers E., Parker W. L. // Filed 07/04.72. Issued 24/12.74. United States Patent Office.
7. Pat.4341768 USA. A novel peptide antibiotic complex designated herein as Bu-2470 is produced by fermentation of Bacillus circulans strain G493-B6/Masataka K., Takeo M., Hiroshi T., Hiroshi K. // Filed 03.04.81; Issued 27.07.82. United States Patent Office.
8. Piuri M., Sanchez-Rivas C., Ruzal S. M. A novel antimicrobial activity of a Paenibacillus polymyxa strain isolated from regional fermented sausages // Letters in Applied Microbiology. 1998. Vol.27. P.9-13.
9. He Z., Kisla D., Zhang L. et al. Isolation and identification of a Paenibacillus polymyxa strain that coproduces a novel lantibiotic and polymyxin // Applied and Environmental Microbiology. 2007. Vol.73, № 1. P.168-178.
10. Svetoch E. A., Stern N. J., Eruslanov B. V. et al. Isolation of Bacillus circulans and Paenibacillus polymyxa strains inhibitory to Campylobacter jejuni and characterization of associated bacteriocins // J. Food Protection. 2005. Vol.68. P.11-17.
11. Похиленко В.Д., Перелыгин В.В., Калмантаев Т.А. и др. Культуральные особенности бацилл группы circulans-subtilis-polymyxa как продуцентов бактерицидных веществ широкого спектра действия // В мире научных открытий. 2010. № 5 (11). Ч.1. С.64-72.
12. Todar K. Online Textbook of Bacteriology. URL: http://www.textbookofbacteriology.net/ Bacillus.html © 2009 Kenneth Todar, PhD.
13. Петерсон А.М., Глинская Е.В., Пермякова Н.Ф. Микробоценоз яблонной тли // Известия Саратовского университета. Сер. Химия. Биология. Экология. 2008. Т.8, № 2. С.79-83.
14. Њwiкcicka I. Protein profile and biochemical properties of Bacillus circulans isolated from intestines of small free-living animals // Folia Microbiologica. 2001. Vol.46. Р.165-171.
15. Kumar M., Philip L. Enrichment and isolation of a mixed bacterial culture for complete mineralization of endosulfan // J. Environmental Science and Health. 2006. Vol.41. P.81-96.
16. Bacillus cereus and B. circulans - novel inoculants for crops / Scientific Correspondence Current Science. 2006. Vol.90, № 5. P.642.
17. Михайловская Н.А., Касьянчик С.А., Миканова О. Влияние бактериального удобрения калиплант на использование калия зерновыми культурами и горохом на дерново-подзолистой супесчаной почве // Известия Национальной АН Белоруссии. 2009. № 3. С.42-48.
18. Патент РФ № 2252959. Способ получения бактериального ферментного препарата пектин-лиазы / Иваненко А.А., Сафонов В.С., Змеева Н.Н., Чурбанов В.Г., Саитова Н.А. // Опубликовано: 27.05.2005. Бюл. № 15.7 с.
19. Shagger H. Tricine dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa // Folia Microbiologica. 1987. № 166. P.368-379.
20. Murray F. J., Tetrault P. S., Kaufmann O. W., Koffler H. Circulin, an antibiotic from an organism resembling Bacillus circulans // J. Bacteriology. 1949. Vol.57. P.305-312.
21. Watanabe T., Oyanagy W., Suzuki K., Tanaka H. Chitinase system of Bacillus circulans WL12 and importance of chitinase A1 in chitin degradation // J. Bacteriology. 1990. Vol.172. P.4017 - 4022.
22. Megadi V. B, Tallur P. N., Hoskeri R. S. et al. Biodegradation of pendimethalin by Bacillus circulans // Indian J. Biotechnology. 2010. Vol.9. P.173-177.
23. Czaczyk K., Bialaz W., Myszka K. Cell surface hydrophobicity of Bacillus spp. as a function of nutrient supply and lypopeptides biosynthesis and its role in adhesion // Polish J. Microbiology. 2008. Vol.57, № 4. P.313-319.
24. Nam D. H., Ryu D. D. Relationship between butirosin biosynthesis and sporulation in Bacillis circulans // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1985. Vol.27, № 5. P.798-801.
25. Kurusu K., Ohba K., Arai T., Fukushima K. New peptide antibiotics LI-FO3, FO4, FO5, FO7, and FO8, produced by Bacillus polymyxa I. Isolation and characterization // J. Antibiotics. 1987. Vol.40. P.1506-1514.
26. Raza W., Yang W., Shen Q-R. Paenibacillus polymyxa: Antibiotics, hydrolytic enzymes and hazard assessment // J. Plant Pathology. 2008. Vol.90, № 3. P.419-430.
27. Klaenhammer T. R. Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria // FEMS Microbiology Reviews. 1993. Vol.12. P.39-86.
28. Похиленко В.Д., Перелыгин В.В. Бактериоцины: их биологическая роль и тенденции применения // Электронный научный журнал "ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ". URL: http://zhurnal. ape. relarn.ru/articles/2011/016. pdf. С.164-198.
29. Burianek L. L., Yousef A. E. Solvent extraction of bacteriocins from liquid cultures // Letters in Applied Microbiology. 2000. Vol.31. P. 193-197.