Т.А. Калмантаев, Г.Т. Садикова, В.В. Перелыгин, В.Д. Похиленко
Бактериоциноподобное вещество Bacillus circulans 1
Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии
Бактериоциноподобное вещество Bacillus circulans и способ его получения
Т.А. Калмантаев, Г.Т. Садикова,
В.В. Перелыгин, В.Д. Похиленко
Аннотации
Исследована зависимость выхода бактериоцидноподобного антимикробного вещества, синтезируемого штаммом Bacillus circulans Ск2ч в процессе глубинного культивирования, от вида источника азота и углерода в питательной среде. Показано, что это вещество начинает накапливаться в культуральной жидкости после 18 ч роста при 30°С, достигая максимальных значений после 2 сут инкубации штамма, когда в клетках еще не заметны признаки спорообразования. Для его выделения из культуральной жидкости наиболее эффективным оказался метод двухфазного разделения с применением органического растворителя дихлорметана. Установлено, что за проявление антимикробной активности бактериоциноподобного вещества отвечает пептид с молекулярной массой 5-6 кДа.
Ключевые слова: микроорганизмы; бактериоцины и бактериоциноподобные вещества; антимикробная активность.
The development of antibiotic resistance is a key problem for a health care service. An approach to solve it relies on limited and reasonable application of antibiotics as well as on utilization of some other substances with more efficient mechanisms of antimicrobial action. Low-molecular-weight peptides called bacteriocins kill cells by making pores in cell walls irrespective of their antibiotic resistance. In this context, of particular interest are some representatives of the genus of Bacillus, especially of species circulans-polymyxa, producing bacteriocins and wide-spectrum activity bacteriocin-like substances. However, production of the substances in sufficient amounts for practical application is still doubtful.
Objectives of the research were to study factors that might influence production of the bacteriocin-like substance Сk2th by newly isolated strain B. circulans, and to select an appropriate procedure for isolation of the substance from fermentats to assess then its properties.
The strain was proliferated and subcultured on nutrient agar at 30°С for two days. An appropriate composition of nutrient broth for submerged cultivation of the strain was selected using 750 ml flasks containing 100 ml of nutrient media. Bactericidal activity of the substance was determined by placing samples of desired volumes in Petri dishes containing freshly seeded lawns of test strains of Gram-positive and Gramnegative microorganisms. The activity was expressed in arbitrary units (AU) measured for 1ml or 1mg of the sample depending on the level of dilution. Such methods as salt precipitation (ammonium sulfate), solid carrier sorption (silica gel, carbon, aluminum oxide, aerosil) and organic solvent two-phase separation (dichlormethane, chloroform, toluene) were tested for isolation of active substances from fermentats. Molecular identification of the bacteriocin-like substance was performed by SDS PAGE followed by 5% glutaraldehyde fixation and coomassie staining. Before biological testing the gel was washed, placed in a Petri dish and overlaid with melted agar containing test cells. After incubation zones of inhibition of the growth of the test strain were fixed against markers.
The dependence between the yield of B. circulans Сk2th and a type of nitrogen and carbon source in the medium and time of submerged cultivation was determined. The method of two-phase separation in the presence of dichlomethane was found to be the most effective one to isolate the product from the culture fluid. A 5-6kDa peptide was shown to be responsible for antimicrobial action of the bacteriocin-like substance, making it quite different from all known antibiotics.
Key words: microorganisms; bacteriocins and bacteriocin-like substances; antimicrobic activity.
антимикробное вещество штамм пептид
Введение
За последние 30 лет было выделено множество разнообразных антибиотикорезистентных микроорганизмов, на которых не действует большинство известных антибиотиков, поэтому поиск новых антибактериальных веществ c меньшей степенью привыкания к ним возбудителей болезней, чем у классических антибиотиков, является актуальной задачей. Достаточно обширным, но еще малоизученным источником получения такого рода средств имеют представители аэробных спороформирующих бацилл [1].
Микроорганизмы рода Bacillus способны синтезировать антибиотики и биосурфактанты [2, 3], бактериоцины и бактериоциноподобные субстанции [1]. Антимикробную активность бацилл чаще связывают с представителями кластера видов circulans-polymyxa [4, 5]. Длительное время считалось, что антимикробные свойства этой группы бацилл обусловлены в основном продукцией пептидных антибиотиков широкого спектра действия [5], которые способны подавлять не только различные грамположительные и грамотрицательные бактерии, но и патогенные грибы Candida albicans [6, 7]. Однако еще в 1998 г. Puiri et al. [8] из Paenibacillus polymyxa выделили новую неизвестную ранее бактериоциноподобную субстанцию с молекулярной массой около 10 кДа, которая не была классическим антибиотиком полимиксином, но ингибировала рост как грамотрицательных, так и грамположительных микроорганизмов. Она имела пептидную природу, была термостабильна, нечувствительна к органическим растворителям, хелаторам, к кислым значениям рН, но разрушалась в щелочных условиях. В последующем факт синтеза P. polymyxa бактериоцинов класса I (лантибиотики по Kleienhammer) был подтвержден сотрудниками Университета штата Огайо [9]. Способность к продукции бактериоцинов была обнаружена и среди представителей B. circulans [10]. Так, при определенных условиях выращивания штамм B. circulans 1580 был способен синтезировать бактериоцин с молекулярной массой 3,9 кДа [10], но технология его извлечения не отработана. Показана способность выделенных из природы штаммов B. circulans к росту в растительных отварах с одновременным накоплением антимикробных веществ широкого спектра антимикробного действия [11]. Активности получаемых при этих условиях ферментатов были невысоки, поскольку ни среды, ни условия культивирования этих микроорганизмов специально не подбирались.
При выборе штамма-продуцента полезных веществ серьезное внимание уделяется его безвредности. Известно, что бактерии группы B. circulans безвредны для животных и растений [12]. Они обнаруживаются в пищеварительном тракте насекомых [13], кишечнике грызунов и насекомоядных животных [14], вместе с другими почвенными бациллами ускоряют процессы минерализации органического вещества [15], стимулируют микробную ризосферу [16]. На основе B. circulans выпускается биопрепарат калиплант, который ускоряет рост культурных растений [17], а также ферментный препарат для мацерации кормов животных [18].
Целью данной работы было исследование факторов, влияющих на продукцию штаммом B. circulans бактериоцидноподобного вещества и выбор способа его выделения для последующего изучения.
Материалы и методики исследования
Объект исследования. В работе использован выделенный из настоя соломы штамм Ск2ч, который по совокупности морфокультуральных и биохимических (API 50 CHB, BioMerieux) свойств был идентифицирован как Bacillus circulans II. Штамм хранится в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур "ГКПМ - Оболенск" (регистрационный № 6861).
Питательные среды и условия культивирования. Размножение клеток штамма осуществляли на питательном агаре (Nutrient Agar M001, HiMedia, India; Starch agar, Ref.1-283, Scharlau, EU; ГРМ агар, ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск, Россия) при 30°С в течение 2 сут. Первичное пассирование клеток штамма осуществляли в аналогичных условиях.
В опытах по глубинному культивированию одиночные типовые колонии штамма переносили в пробирку со стерильным изотоническом раствором хлористого натрия (физраствор) и суспендировали с использованием встряхивателя BioVortex V1 ("Biosan", CЄ), ориентируясь на получение 1 млрд взвеси клеток/1 мл по стандарту мутности Л.И. Тарасевича. Микробной взвесью (1%, объем/объем) засевали качалочные колбы (объем 750 мл) со 100 мл питательных сред. За основу питательных сред была взята пропись в составе (г/л): дрожжевой экстракт - 5,0; калия фосфат двухзамещенный трехводный - 3,0; натрия хлорид - 1,0; калия хлорид - 1,0 и магния сульфат - 0,005 (рН 7,3-7,5).
На первом этапе исследований к основе среды отдельно (по 0,5%) добавляли различные источники азота: виннокислый аммоний, сульфат аммония, хлористый и щавелевокислый аммоний, солянокислый гидролизат казеина, панкреатический гидролизат рыбной муки (ПГРМ), глутамат натрия и др. Во всех вариантах этих сред в качестве источника углерода использовали глюкозу (0,6 ± 0,1%; вес/объем). Контролем был коммерческий ГРМ-бульон (ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск, Россия).
На втором этапе исследований в качестве питательной основы использовали пропись, выбранную по результатам первого этапа, с дополнительным введением вместо глюкозы других источников углерода - моно-, ди-, три-, олиго - и полисахаридов.
Инкубация всех вариантов посевов проводилась при 29-30°С в колбах на 750 мл со 100 мл среды в термостатируемой качалке ("New Brunswick Scientific", USA) при 130 об. /мин в течение 24-96 ч. В процессе инкубации отбирали пробы культуральной жидкости (КЖ), в которых определяли количество живых клеток (чашечный метод), начало образования спор (микроскопический метод) и синтеза бактерицидных веществ.
Метод оценки антимикробной активности. При определении бактерицидной активности пробы КЖ осаждали в микрофуге MiniSpain ("Eppendorf AG 22232", Germany), освобождали от клеток и по 10 мкл наносили на свежезасеянные газоны тест-штаммов. С целью более точной оценки бактерицидной активности этих проб проводили их концентрирование методом выпаривания в анализаторе влажности MF-50 ("Moisture Analyzer", Japan). Антагонистическая активность выражалась в арбитражных единицах (АЕ), отнесенных к 1 мл или 1 мг пробы: одна АЕ соответствовала максимальному разведению, при котором была заметна зона ингибирования тест-штамма.
Методы получения антимикробного вещества. Выделение грубых экстрактов бактериоциноподобного вещества (БПВ) с антимикробной активностью проводили из бесклеточного супернатанта и клеточной массы (КМ), которые получали центрифугированием КЖ при 8 000 об. /мин в течение 30 мин ("Beckmann J2.2", Germany). При отработке способа выделения БПВ из супернатантов применяли методы солевой преципитации (сульфат аммония), сорбции на твердых носителях (силикагель, уголь, окись алюминия, аэросил) с последующим элюированием с них, а также жидкостного разделения при помощи растворителей (дихлорметан, хлорофом, толуол) и концентрированием целевого вещества на границе раздела в интерфазную пленку (ИП). Осадки КМ вначале ресуспендировали добавлением в 400-миллиметровый центрифужный стакан по 1 мл физраствора, далее суспензию разводили 5 частями 80% -ного этанола (объем/объем) и после 30 мин перемешивания разделяли центрифугированием (4 000 об. /мин, 10 мин).
Для удаления растворителей полученные образцы межфазных пленок и спиртовые элюаты досуха упаривали при нагревании до 105°С. Получаемые осадки с учетом их массы регидратировали в дистиллированной воде и сравнивали между собой по титру антимикробной активности. При этом исходные и серийно разведенные растворы БПВ наносили (по 10 мкл) на поверхность свежезасеянных газонов индикаторных грамотрицательных и грамположительных бактерий (в основном штаммы Escherichia coli и Listeria monocytogenes соответственно).
Оценка молекулярной массы бактерицидного вещества проводилась с помощью метода электрофореза с додецилсульфатом натрия (ДСН/SDS) в полиакриаламидном геле (ПААГ/PAAG) в камере фирмы "Hoefer" (США) по Шаггеру [19]. В качестве маркеров использовали фармакопейный инсулин ("ОАО Национальные биотехнологии", п. Оболенск, Россия) и лизоцим гидрохлорид ("Reanal", Hungary). В лунки подготовленного геля вносили исследуемые образцы и указанные маркеры (по 4 мкл). Концентрация разделяющего геля составляла 16,5%, концентрирующего - 10%. Форез вели в катодном (100 мМ Трис-НСl, 100мМ, 0,1% SDS, рН 8,25) и анодном (200 мМ Трис-НСl, рН 8,9) буферах в камере для вертикального электрофореза указанной фирмы при U = 125 V и I = 25 мА в течение 4 ч. Последующую фиксацию пептидов проводили в 5% -ном растворе глутарового альдегида в течение 30 мин с промывкой в дистиллированной воде. Окраску геля проводили в растворе, содержащем 25% этанола, 10% уксусной кислоты, 0,001% Кумасси G250 и воды (до 500 мл), в течение 30 мин. Гель далее отмывали в 10% -ном растворе уксусной кислоты при температуре 80°C в течение 2 ч и еще 30 мин - дистиллированной водой.
Хроматография. Для разделения БПВ по методу тонкослойной хроматографии (ТСХ) использовались полоски (30 Ч 150 мм) алюминиевой фольги, покрытой силикагелем марки Silufol ("Kavalier", Czechoslovakia) [16], на линию старта которых наносились пробы (по 4 мкл). Хроматографию проводили в системе растворителей: бутанол - уксусная кислота - вода (4: 1: 2,5) при комнатной температуре. Пластины высушивали, просматривали в ультрафиолете и, при необходимости, прокрашивали аэрозольным нанесением раствора нингидрина.
Биотестирование активной фракции. Биотестирование электрофоретически и хроматографически разделенных образцов БПВ осуществляли заливкой пластины ПААГ расплавленной агаровой взвесью или же накладкой разрезанных на кусочки (1,5 Ч 0,5 см) хроматографических полосок на свежие газоны индикаторных культур в чашках Петри. После 6-18 ч инкубации посевов фиксировали наличие и места расположения зон ингибирования роста тест-штаммов.
Результаты исследования и обсуждение
Было установлено, что при глубинном культивировании штамма В. circulans Ск2ч в питательных средах, различающихся по составу азотсодержащих соединений, уровень накопления БПВ был различен. Так, из данных табл.1 видно, что если в качестве источника азота в составе среды использовались гидролизаты белков животного происхождения (казеин и рыбная мука), то БПВ не обнаруживалось, несмотря на весьма высокие показатели концентрации живых клеток (3-8 Ч 108 КОЕ/мл) в КЖ.