Статья: Ассоциация сахарного диабета 1-го типа с полиморфными аллелями генов HLA класса II в популяции якутов

¹ФГЕНУ «Якутский научный центр комплексных медицинских проблем»

²Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «СевероВосточный федеральный университет имени М.К. Аммосова»

³ГЕУ РС (Я) «Якутская республиканская клиническая больница»

⁴ГАУРС(Я) «РЕ№ 1-НЦМ» Отделение детской эндокринологии

5ФГЕОУ ВО «Якутская ГСХА»

Ассоциация сахарного диабета 1-го типа с полиморфными аллелями генов HLA класса II в популяции якутов

Павлова Н.И.¹, Куртанов Х.А.¹, Дьяконова А.Т.¹,

Соловьева Н.А.¹, Сыдыкова Л.А.^2,3, Александрова Т.Н.¹,

Филиппова Н.П.¹, Никифорова М.Е., Додохов В.В.^1,5

Впервые в якутской популяции проведен молекулярно-генетический анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфизмов rs3104413, rs2854275 и rs9273363 генов HLA-DQA1 и HLA-DQB1 соответственно. Протестированы 92 пациента с диагнозом СД 1-го типа, из которых 44 мужчины, 48 женщины. Средний возраст пациентов составил 23,04±0,27 года (от 4 до 56 лет). В качестве группы сравнения была сформирована выборка из здоровых добровольцев в количестве 210 человек.

Амплификация области гена HLA-DQA1, содержащего однонуклеотидный полиморфизм rs3104413, осуществлялась в процессе ПЦР в реальном времени, области гена HLA-DQB1 содержащих полиморфизмы rs2854275 и rs9273363 - аллель специфичной ПЦР. Анализ распределения генотипов показал, что наиболее распространенным генотипом по полиморфизму rs3104413 в группе больных СД 1 является С/С (69,6%), тогда как в контрольной группе чаще встречался гомозиготный вариант G/G (41,1%). Выявлено, что самым распространенным генотипом полиморфного варианта rs2854275 в группе контроля является гомозиготный генотип G/G (88,5%), а в группе больных СД 1-го типа - генотип G/Т (56,3%). Полиморфный вариант rs9273363 характеризовался достоверно низкой частотой аллеля А (1,5%) в группе здоровых индивидов по сравнению с группой больных СД 1-го типа (53,6%). Наиболее высокие показатели относительного риска (RR) среди генотипов выявлены для сочетания генотипа С/С полиморфизма rs3104413 с гетерозиготным генотипом G/T полиморфизма rs2854275 - RR составил 4,234 (р<0,001); для сочетания генотипа С/С полиморфизма rs3104413 с генотипом Т/Т полиморфизма rs2854275 RR = 3,692 (р<0,001); для сочетания генотипа G/G полиморфизма rs3104413 с генотипом А/С полиморфизма rs9273363 RR = 3,625 (р<0,001). Полученные данные могут быть использованы в качестве биологических предикторов развития СД 1-го типа с целью проведения своевременных персонализированных профилактических мероприятий.

Ключевые слова: гены HLA II класса, сахарный диабет 1-го типа, полиморфизм, якуты

Введение

Сахарный диабет 1-го типа (СД 1) - метаболическое (обменное) заболевание, характеризующееся гипергликемией, в основе которого лежит деструкция Р-клеток, приводящая к абсолютному дефициту инсулина.

Сахарный диабет представляет собой важнейшую медико-социальную проблему во всем мире. Это объясняется его широким распространением, тяжестью поздних осложнений, дороговизной средств диагностики и лечения, которые необходимы больным в течение всей жизни. По данным Росстата на сегодняшний день в мире насчитывается более 400 млн человек, больных СД, и распространенность заболевания продолжает неуклонно расти. На начало 2017 г. общая численность пациентов, страдающих СД, в РФ составила 4,348 млн человек, из них: 4 млн - СД 2-го типа, 255 тыс. - СД 1-го типа и 75 тыс. - СД других типов. По последним данным в Республике Саха (Якутия) с диагнозом СД проживают 21 677 человек, из них: 20 508 - это пациенты с СД 2-го типа, 1099 - больные СД 1-го типа, 70 человек страдают СД других типов [1].

Согласно современным данным в развитии СД 1-го типа принимают участие большое число генов [2], более половины генетических рисков обусловлено участием полиморфных вариантов генов HLA, расположенных на коротком плече хромосомы 6 (6p21). Полагая, что вклад генетических факторов в риск развития СД 1-го типа составляет более 50%, полный вклад полиморфных аллелей локуса HLA может быть оценен более чем 25%.

В России исследования по определению HLA-аллелей с использованием однонуклеотидных полиморфизмов не проводятся. В связи с этим на сегодняшний день существует необходимость в проведении исследований, направленных на разработку регионально-адаптированного метода HLA-типирования СД 1-го типа с помощью однонуклеотидных полиморфизмов (SNP).

Целью данного исследования являлось выявление ассоциации полиморфных вариантов генов HLA II класса с СД 1 -го типа среди якутской популяции.

Материалы и методы исследования

Экспериментальная часть работ по генотипированию полиморфизмов rs3104413, rs2854275, rs9273363 была проведена в лаборатории наследственной патологии отдела молекулярной генетики Якутского научного центра комплексных медицинских проблем (ЯНЦ КМП). Для исследования использованы образцы ДНК из коллекции биоматериала ЯНЦ КМП с применением УНУ «Геном Якутии» (рег. № USU_507512). Выборка состояла из 92 пациентов больницы ФГБНУ «Якутский научный центр комплексных медицинских проблем», ГАУ РС(Я) РБ № 1 НЦМ Педиатрический центр и эндокринологического отделения ГБУ РС (Я) «Якутская городская клиническая больница» г. Якутска. В состав выборки вошли 92 пациента с диагнозом СД 1-го типа в возрасте от 4 лет до 56 лет, проживающих в РС (Я), якутов по этнической принадлежности. По половому признаку пациенты разделились на 44 мужчин (47,8%) и 48 женщин (52,2%). Средний возраст пациентов составил 23,04±0,27 года (от 4 до 56 лет), средний возраст пациентов мужского пола - 20,5±2,3 года (от 5 до 40 лет), женского пола - 25,11±2,59 года (от 4 до 56 лет). Популяционную выборку составили 210 якутов, не страдающих СД 1-го типа. Этническая принадлежность учитывалась до третьего поколения.

Амплификация области гена HLA-DQA1, содержащего однонуклеотидный полиморфизм rs3104413, осуществлялась в процессе ПЦР в реальном времени с использованием пар праймеров и аллельспецифичных зондов для амплификации ДНК, описанных в журнале «NATURE COMMUNICATIONS» (Isabelle Serr et al., 2015). Праймеры и зонды синтезированы компанией ООО «Биотех-Индустрия (Lumiprobe)» (Москва, Россия). Последовательность праймеров: Форвард праймер 5'-CAGCTGAGCACTGAGTAG-3', реверс праймер 5'-GCAGTTGAGAAGTGAGAG-3'. Структура зондов: FAM - Probe rs3104413 LPC [6FAM]CAGCCT[+G]CT[+C]TC[+C]TA[+T]TGG[BHQ1], HEX - Probe rs3104413 LPG [HEX]CAGCCT[+G]CT[+G]TC[+C]TA[+T]TGG[BHQ1].

Амплификация проводилась согласно температурной программе, приведенной ниже (табл. 1).

Таблица 1

Температурная программа амплификации полиморфизма rs3104413

Измерение сигнала флуоресценции проводилось на втором этапе реакции (55°С - 1:00). Детекция флуоресценции осуществлялась «по конечной точке» согласно протоколу прибора «Real-time CFX 96 Touch» («Biorad», США). Пример распределения облаков генотипов проведения ПЦР и детекции флуоресценции «по конечной точке» представлен на рисунке 1. Соответствие флуоресцентных красителей: аллель C - канал FAM, аллель G - канал HEX.

Рис. 1. Распределение облаков генотипов полиморфизма rs3104413 гена HLA-DQA1.

Примечание: «К-» - отрицательный контроль, C/C - гомозигота по предковому аллелю C. C/G - гетерозигота, G/G - гомозигота по мутантному аллелю G

Анализ однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) rs2854275, rs9273363 проводился с помощью аллельспецифичных праймеров (АС-ПЦР). Праймеры были синтезированы компанией ООО «Сибэнзим» (г. Новосибирск, Россия). В рамках настоящей работы были созданы оригинальные аллельспецифичные праймеры на основе референсного генома hg38/Human по базе UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/index.html). Последовательность праймеров и условия ПЦР представлены в таблице 2.

Таблица 2

Последовательность праймеров и условия АС-ПЦР*

Примечание. * - АС-ПЦР - аллель-специфическая ПЦР, ** - п.о. - пара оснований. *** - Dominquez O et al., 1992; Michelle A.M. et al., 2000; Steffens Nakken et al., 1995

генотип полиморфизм амплификация

Результаты амплификации и рестрикции фракционировали в 3-4%-ном агарозном геле с бромистым этидием при напряжении 120-300 Вт в течение 30-45 мин. Анализ результатов электрофореза проводили под UV-лучами в гель-документирующем приборе УііЬєг Lourmat (рис. 2, 3).

Рис. 2. Электрофореграмма продукта амплификации rs2854275 в 2%-ном агарозном геле Примечание: п.н. - пар нуклеотидов. М - ДНК маркер pUC19/MspI. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 - нумерация образцов. 270 п.н. - внутренний контроль. 192 п.н. - аллель T, 134 п.н. - аллель G

Рис. 3. Электрофореграмма продукта амплификации rs9273363 в 2%-ном агарозном геле Примечание: п.н. - пар нуклеотидов. М - ДНК маркер pUC19/MspI. 1, 2, 3, 4, 5 - нумерация образцов. 270 п.н. - внутренний контроль. 141 п.н. - аллель A, 146 п.н. - аллель C

Статистический анализ полученных результатов медико-генетического исследования был проведен с помощью программы: «Office Microsoft Excel 2010», «Statistica 8.0». Частоты аллелей и генотипов rs3104413, rs2854275 и rs9273363 определяли путем прямого подсчета.

Результаты считались значимыми, когда значение «р» было меньше 0,05 (p<0,05).

Результаты исследования и их обсуждение

В результате проведенного анализа установлено, что только для полиморфного варианта rs2854275 в популяции якутов наблюдаемое распределение генотипов соответствовало ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга (РХВ). Отклонение установлено для полиморфного варианта rs3104413 (Х²=65,966, р<0,001), которое характеризовалось уменьшением уровня наблюдаемой гетерозиготности (Но=0,219) по сравнению с ее ожидаемым уровнем (Не=0,498). Для полиморфного варианта rs9273363 (Х² = 134, р<0,001), которое характеризовалось уменьшением уровня наблюдаемой гетерозиготности (Но=0,0) по сравнению с ее ожидаемым уровнем (Не=0,029) (табл. 3).

Таблица 3

Распределение генотипов и аллелей полиморфизмов rs3104413, rs2854275, rs9273363 в популяционной выборке якутов

Примечание: n - численность выборки, Ho, He - наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность, Х² по Харди-Вайнбергу, р - уровень достоверности

Согласно базе данных проекта «1000 геномов» для полиморфизма rs3104413 во всех исследованных выборках популяций мира установлены высокая частота мутантного аллеля С (78-92%) и низкая частота предкового аллеля G (8-22%) [5]. В исследованной выборке якутов частота предкового аллеля G была выше и составила 52,9%, тогда как частота мутантного аллеля С характеризовалась более низкими значениями и составила 47,1%, что может быть следствием как недостаточного объема выборки, так и этнической особенности.

Для полиморфизма rs2854275 в исследованной выборке якутов частота предкового аллеля G (92,1%) преобладала над частотой мутантного аллеля Т (7,9%), что сопоставимо с результатами ранее проведенных исследований, в которых отмечаются высокая частота предкового аллеля G (90-97%) и низкая частота мутантного аллеля Т(3-10%) [5].

Полиморфизм rs9273363 у якутов характеризовался преобладанием частоты предкового аллеля С (98,5%) по сравнению с частотой мутантного аллеля А (1,5%), что согласуется с результатами ранее проведенных исследований, в которых отмечаются высокая частота предкового аллеля С (67-91%) и низкая частота мутантного аллеля А (933%) [5].

Результаты анализа распределения частот аллелей и генотипов полиморфизмов rs3104413, rs2854275 и rs9273363 среди больных СД 1-го типа и контрольной выборки представлены в таблице 4.

Таблица 4 Частота встречаемости генотипов и аллелей полиморфизмов rs3104413, rs2854275 и rs9273363 в группе больных СД 1-го типа и контрольной выборки