ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России
Адаптация и гетерогенность популяции штаммов Burkholderia cepacia complex в условиях хронической инфекции при муковисцидозе
Кондратенко Ольга Владимировна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии
Муковисцидоз является самым частым наследственным заболеванием, его прогноз, а также продолжительность жизни пациентов обусловлены тяжестью респираторной патологии. В ряду наиболее прогностически неблагоприятных возбудителей муковисцидоза лидируют бактерии Burkholderia cepacia complex. При бронхопульмональной колонизации они способны приводить к развитию «cepacia»-синдрома, являющегося одной из основных причин летальности пациентов. С момента начала колонизации и до ее завершения в микробной популяции происходит большое количество приспособительных изменений, направленных на ее сохранение. Одним из таких процессов можно считать явление гетерогенности, микробиологическое и клиническое значение которого показано в обзоре, отражающем опыт европейских исследователей. Кроме того, освещены и другие адаптационные процессы. Показано, что штаммы, изолированные в начале и в конце инфекции, различаются по морфологическим и культуральным свойствам, чувствительности к антибиотикам и ультрафиолетовому облучению, способности к адгезии и инвазии, а также продукцииО-антигена и способности к утилизации железа.
Ключевые слова: гетерогенность, Burkholderia cepacia complex, муковисцидоз, адаптация, О-антиген.
ADAPTATION AND HETEROGENEITY OF BURKHOLDERIA CEPACIA COMPLEX STRAINS POPULATION IN CONDITIONS OF CHRONIC INFECTION IN CYSTIC FIBROSIS
Kondratenko Olga V., Cand. Sci. (Med.), Associate Professor of Department, Samara State Medical University
Cystic fibrosis is the most common hereditary disease, the life expectancy and prognosis of which is determined by the severity of respiratory pathology. One of the most prognostically unfavorable pathogens in this disease are bacteria Burkholderia cepacia complex. With bronchopulmonary colonization, they can lead to the development of “cepacia” - a syndrome that is one of the main causes of mortality in patients. From the beginning of colonization until its completion, a significant number of adaptive changes aimed at its preservation occur in the microbial population. One of such processes can be considered the phenomenon of heterogeneity. The review shows the experience of European researchers, reflecting the microbiological and clinical significance of this phenomenon, as well as a number of other adaptation processes. It is shown that strains isolated at the beginning and end of infection differ in their morphological and cultural properties, sensitivity to antibiotics and ultraviolet radiation, ability to adhesion and invasion, as well as the production of O-antigen and the ability to utilize iron.
Key words: heterogeneity, Burkholderia cepacia complex, cystic fibrosis, adaptation, O-antigen.
Муковисцидоз (МВ) является наиболее распространенным наследственным заболеванием, обусловленным мутацией гена, который расположен на длинном плече седьмой хромосомы, и передающимся по аутосомно-рецессивному пути при наследовании двух мутантных аллелей. В результате мутации гена происходит нарушение синтеза, структуры и функции белка трансмембранного регулятора проводимости, поэтому хлорные каналы становятся патологически непроницаемыми для ионов хлора при гиперабсорбции натрия и одновременном поступлении в клетку воды, что вызывает дегидратацию апикальной поверхности секреторного эпителия и увеличение вязкости слизи. Заболевание является мультисистемным, поражающим преимущественно дыхательные пути, желудочнокишечный тракт, печень, поджелудочную железу, а такжеслюнные, потовые железы, репродуктивную систему. При этом патология дыхательных путей является основной причиной осложнений и летальности. Генетический дефект, лежащий в основе патогенеза МВ, как известно, приводит к повышению вязкости респираторного секрета, что создает комфортные условия для роста и размножения бактериальной популяции [1, 2, 4, 5].
В структуре основных бактериальных патогенов при МВ можно выделить Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Achromobacter xylosoxidans. Однако наиболее «проблемными» возбудителями в настоящее время считаются бактерии Burkholderia cepacia complex [1, 2, 3]. Изначально выделенные В. Буркхольдером как фитопатогены, уже через год они были описаны как возбудители инфекций человека, а спустя несколько лет выделены и от пациентов с МВ. Сегодня бактерии группы Burkholderia cepacia complex являются одними из самых прогностически неблагоприятных патогенов при МВ, способных к формированию хронической инфекции, которая приводит в 20 % случаев к развитию «cepac-синдрома [1, 4].
Виды Burkholderia cepacia complex характеризуются высокой пластичностью генома, что дает им большое преимущество в адаптации в стрессовой среде легких [9, 13, 15]. Широко распространенное положительное селективное давление в геноме Burkholderia cepacia complex приводит к появлению множества фенотипических клональных вариантов, которые демонстрируют различные паттерны антибиотикорезистентности и другие различия [8, 12, 22]. Понимание основных механизмов, используемых бактериями Burkholderia cepacia complex для адаптации к среде дыхательных путей, имеет решающее значение для борьбы с хронической инфекцией и оптимизации терапии. Изучение механизмов и динамики эволюции микробов в среде хозяина и ее взаимосвязи с патогенностью и вирулентностью в настоящее время являются предметом первостепенной важности в науках о здоровье.
Создание в легких популяции буркхольдерий с высокой плотностью способствует накоплению в ней мутаций и участию мутантных клонов в естественном отборе. Известно, что микробная популяция, особенно при культивировании in vivo, не может оставаться гомогенной по своим свойствам, даже если изначально вся популяция являлась клональным потомком одной клетки. После определенного числа делений в каждой бактериальной популяции появляются генетически гетерогенные особи. Это происходит в результате обмена генетической информацией как в рамках указанной популяции, так и с другими микроорганизмами, присутствующими в легких при МВ. Обмен информацией при этом происходит за счет явлений трансформации, трансдукции, конъюгации, а также при участии мобильных генетических элементов, в частности R-плазмид. Показано, что данные образования способны не только приводить к распространению лекарственной устойчивости, но и увеличивать сроки выживания патогенов в окружающей среде, что является дополнительным фактором, повышающим вероятность инфицирования в условиях стационара и в быту.
В то же время при хронической легочной инфекции условно-патогенные микроорганизмы в дыхательных путях при МВ развиваются в ответ на стресс-селективное давление, оказываемое средой хозяина, в результате действия факторов иммунной системы, антимикробной терапии, снижения доступности питательных веществ и ограничения кислорода. Это приводит к появлению фенотипических вариантов основной клональной популяции, которые проявляют различные паттерны антимикробной восприимчивости, например, размер образованных биопленок и другие фенотипические различия [9].
Гетерогенность популяции для бактерий является важным фактором для сохранения вида. Она повышает надежность существования вида, особенно в условиях вынужденного противостояния неблагоприятным средовым факторам, одним и которых, при хронической инфекции, ассоциированной с Burkholderia cepacia complex, является непрерывная антибактериальная терапия. Появление в составе многомиллионной бактериальной популяции буркхольдерий хотя бы одной особи, устойчивой к применяемому в отношении нее антибактериальному препарату, обеспечивает под его влиянием отбор только резистентных особей и формирование популяции с фенотипом лекарственной устойчивости. По этой причине применение антибактериальных препаратов без изучения и учета клональной структуры популяции может быть объяснением не только отсутствия клинического эффекта от терапии, но и увеличения количества резистентных особей в результате естественного отбора.
Имеющаяся у популяции бактерий изначальная минимальная гетерогенность усиливается и нарастает по мере воздействия на нее неблагоприятных факторов. Возрастает вариабельность клеток по размеру, антибиотикорезистентности, гемолитической активности и другим свойствам. инфекция муковисцидоз гетерогенность
При этом популяция буркхольдерий, выделенных из мокроты пациентов с МВ, может быть морфологически как гомогенной, так и гетерогенной. Получение при культивировании морфологически однородной культуры не исключает вероятности их генетической неоднородности, в том числе и различий по антибиотикорезистентности. По этой причине определение антибиотикорезистентности только одной колонии может не давать или даже искажать данные об устойчивости популяции в целом. Действие на бактериальную популяцию любых факторов, лимитирующих или снижающих ее численность, а особенно прекращение их воздействия, может приводить к росту численности популяции измененного штамма.
Под действием факторов иммунной системы и антибактериальной терапии в гетерогенной популяции происходят наиболее существенные сдвиги, заключающиеся в селекции клонов с опред е- ленным набором биологических признаков. По мере роста и развития часть клонов - определенный фенотип - может исчезать или заменяться другим клональным потомком. Можно предположить, что при МВ исход инфекции, ассоциированной с Burkholderia cepacia complex, в том числе и переход в «серасіа»-синдром, определяется и степенью гетерогенности штамма, колонизирующего дыхательные пути пациента.
Первым случаем описания гетерогенности популяции буркхольдерий при МВ следует считать публикацию исследователей из Португальского центра МВ, где авторы приводят описание двух пар малых и «нормальных» морфотипов данных бактерий, выделенных из мокроты пациентов с МВ. При этом ученые продемонстрировали, что малые колониальные варианты показали себя более устойчивыми к антибактериальным препаратам и ультрафиолетовому облучению. Первое обстоятельство может приводить к неэффективности лечения при использовании стандартных схем терапии, а второе - повышать сроки выживания возбудителей на объектах окружающей среды, тем самым увеличивая вероятность распространения указанного морфотипа среди пациентов. Кроме того, малые колониальные варианты оказались более активными пленкообразователями по сравнению с колониями стандартного размера, а также более вирулентными [8, 9].
Было выяснено, что мутация в гене mavAsRNA у буркхольдерий приводит к формированию морфотипа, устойчивого к имипенему, цефтазидиму, тетрациклину и ко-тримоксазолу, тем самым повышая шансы популяции на выживание [8, 9]. Более резистентные клоны были получены после обострения и более агрессивной терапии. Таким образом, стресс, полученный бактериальной популяцией вследствие действия антибактериальной терапии, приводит к появлению устойчивой популяции [9]. Установлено, что низкое содержание кислорода в легочной ткани при МВ также является важным фактором формирования антибиотикорезистентности [9, 17, 33].
Адаптивным ответом на рост в условиях гипоксии является снижение степени насыщения клеточных мембран жирными кислотами. У штаммов в процессе многолетней колонизации в легких снижается процент насыщения клеточной стенки насыщенными жирными кислотами и повышается содержание ненасыщенных жирных кислот, что является результатом адаптации бактерий к селективному давлению в условиях окислительного стресса и гипоксии [8].
К фенотипическим признакам, связанным с персистентностью и патогенностью бактерий, относится, помимо различий в антибиотикорезистентности, эффективность роста при ограничении доступности железа, а также продукция экзополисахаридов.
Свойства исходного изолята и полученного спустя несколько лет после инфицирования отличались. Сравнение штаммов, выделенных в начале инфицирования и спустя 3 года, показало, что у последних имеется более выраженная устойчивость к антибактериальным препаратам, активация белков и генов, связанных с транспортом железа, более высокая способность к извлечению железа из среды с ограниченным его содержанием. Более высокая способность к поглощению железа является адаптивной чертой, которая способствует повышению устойчивости бактериальной популяции в легочной ткани [9, 37]. В то же время штаммы, выделенные в начале инфицирования, менее приспособлены к росту в условиях ограничения железа.
Изоляты, полученные в последние месяцы жизни пациентов, обнаруживают повышенное содержание белков, поглощающих железо и способных более эффективно захватывать железо из окружающей среды. Четыре белка, участвующих в поглощении железа, более распространены в поздних изолятах. Три из них также сверхэкспрессируются в позднем изоляте по сравнению с ранним. Это предполагаемый белок, взаимодействующий с сидерофором, предполагаемый белок рецептора пио- хелина Fpta и TonB-зависимый рецептор [25]. OrbC, предполагаемо связанный с транспортом железа АТФ-связывающий белок, экспрессия гена которого повышена за счет OrbS в условиях депривации железа, был сверхэкспрессирован только в последнем изоляте. Значительный уровень сидерофоров секретировался изолятами в течение 2 часов после воздействия обедненной железом среды, демонстрируя способность этого вида быстро приспосабливаться к низкой концентрации железа [8].