Статья: VEGF- и EGF-опосредованная кооперация эозинофильных гранулоцитов и опухолевых клеток при раке желудка и толстого кишечника

Сибирский государственный медицинский университет (СибГМУ)

Томский областной онкологический диспансер (ТООД)

Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники (ТУСУР)

VEGF- и EGF-опосредованная кооперация эозинофильных гранулоцитов и опухолевых клеток при раке желудка и толстого кишечника

Колобовникова Ю.В., Янкович К.И.,

Романова Е.В., Дмитриева А.И.,

Уразова О.И., Новицкий В.В., Полетика В.С.

Резюме

секреция рак желудок кишечник

Цель исследования - проанализировать секрецию сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGF) и эпидермального ростового фактора (EGF) эозинофильными гранулоцитами крови in vitro и экспрессию рецепторов VEGFR и EGFR в опухолевой ткани при раке желудка и толстого кишечника в ассоциации с тканевой эозинофилией.

Материалы и методы. Обследовано 52 пациента с раком желудка и 50 пациентов с раком толстого кишечника. Материалом исследования служили супернатанты суспензионной культуры эозинофильных гранулоцитов и образцы тканей злокачественных новообразований желудка и толстого кишечника. Методом иммуноферментного анализа определяли содержание VEGF и EGF в супернатантах культуры эозинофильных гранулоцитов in vitro. Экспрессию VEGFR и EGFR в опухолевой ткани оценивали методом иммуногистохимии. Полученные результаты анализировали статистическими методами.

Результаты. Установлено увеличение базальной и индуцированной рекомбинантным интерлейкином (r-IL) 5 секреции VEGF эозинофильными гранулоцитами крови in vitro у больных раком желудка, сопровождающимся тканевой эозинофилией. Концентрация EGF в культуре эозинофилов крови in vitro при добавлении r-IL-5 повышалась у больных с эозинофильной инфильтрацией опухолевой ткани вне зависимости от локализации патологического процесса как у больных с раком желудка, так и с раком толстого кишечника. Эозинофильная инфильтрация опухолевой ткани при раке желудка и раке толстого кишечника сочеталась с гипоэкспрессией опухолевыми клетками EGFR; экспрессия рецептора VEGFR не зависела от присутствия эозинофильных гранулоцитов в ткани опухолей.

Заключение. Гиперсекреция сосудисто-эндотелиального фактора роста VEGF и эпидермального ростового фактора EGF (при индукции r-IL-5) эозинофилами крови in vitro у больных раком желудка и толстого кишечника с тканевой эозинофилией свидетельствует о повышении активности этих клеток. Дефицит экспрессии в опухолевой ткани рецепторов VEGFR и EGFR обусловливает нарушение кооперативного взаимодействия эозинофильных гранулоцитов и опухолевых клеток при злокачественных новообразованиях желудка и толстого кишечника.

Ключевые слова: эозинофил, ростовые факторы, рецепторы, рак желудка, рак толстого кишечника.

Annotation

VEGF-and EGF-mediated cooperation of eosinophilic granulocytes and tumor cells in gastric and colon cancer

Kolobovnikova Yu.V., Yankovich K.I., Romanova E.V., Dmitrieva A.I. Urazova O.I., Novitskiy V.V., Poletika V.S.

Aim of the research - to analyze secretion of vascular endothelial growth factor (VEGF) and epidermal growth factor (EGF) by blood eosinophilic granulocytes in vitro, together with an expression of VEGFR and EGFR in tumor tissue in gastric and colon cancer in association with tissue eosinophilia.

Materials and methods. A total of 52 patients with gastric cancer and 50 patients with colon cancer were examined. The material of the research included supernatants of eosinophil cultures and samples of malignant tumors tissues of the stomach and colon. Enzyme-linked immunosorbent assay was used to determine the contents of VEGF and EGF in the eosinophil culture supernatants in vitro. The expression of VEGFR and EGFR in tumor tissue was evaluated by immunohistochemistry. The results were analyzed by statistical methods.

Results. An increase in basal and r-IL-5-induced secretion of VEGF by eosinophilic granulocytes of blood in vitro was found in patients with gastric cancer accompanied by tissue eosinophilia. The concentration of EGF in the culture of blood eosinophils in vitro with the addition of r-IL-5 increased in patients with eosinophilic infiltration of tumor tissue, regardless of the localization of the pathological process,both in patients with gastric cancer and colon cancer. Eosinophilic infiltration of the tumor tissue in gastric cancer and colon cancer was combined with hypo-expression of EGFR by tumor cells; VEGFR receptor expression was not dependent on the presence of eosinophilic granulocytes in the tissue of tumors.

Conclusion. Hypersecretion of vascular endothelial growth factor VEGF and epidermal growth factor EGF (upon stimulation with r-IL-5) by blood eosinophils in vitro in patients with gastric and colon cancer with tissue eosinophilia indicates an increase in the activity of these cells. Deficiency of expression of VEGF and EGFR receptors in tumor tissue causes violation of cooperative interaction of eosinophilic granulocytes and tumor cells in malignant tumors of the stomach and large intestine.

Key words: eosinophil, growth factors, growth factor receptors, gastric cancer, colon cancer.

Введение

Опухолевое микроокружение (совокупность элементов стромы и клеток) в значительной степени определяет рост и прогрессию опухоли [1]. Регуляторное влияние клеток микроокружения может быть направлено на поддержание равновесия между резистентными и чувствительными клонами, обеспечение условий для «дремлющего» состояния опухоли [2]. Роль эозинофила как элемента опухолевого микроокружения рассматривается неоднозначно. В литературе превалирует мнение о противоопухолевом цитотоксическом потенциале эозинофильных гранулоцитов [3-5]. Вместе с тем зарубежными авторами подробно описаны рецепторы и широкий спектр гуморальных факторов, посредством которых эозино- филы могут участвовать в механизмах развития опухолей [6].

Эозинофильные гранулоциты секретируют сосудисто-эндотелиальный фактор (vascular endothelial growth factor (VEGF)) и эпидермальный ростовой фактор (epidermal growth factor (EGF)). Подобно гормонам, эти факторы обладают плейо- тропностью биологического действия и способны оказывать разного рода рецептор-зависимые эффекты на многие клетки - стимулировать или ингибировать их деление, хемотаксис, созревание. Доказана их роль в патогенезе опухолевой прогрессии [7, 8]. Взаимодействие EGF со своим рецептором активирует синтез белков и пролиферацию опухолевых клеток [9]. При действии VEGF образуются новые кровеносные и лимфатические сосуды, опосредующие формирование метастазов опухоли [10]. Высокая экспрессия рецепторов к VEGF и EGF (VEGFR и EGFR) в опухолевой ткани диагностируется при злокачественных новообразованиях различных гистологических типов и локализаций, что может быть негативным критерием их прогноза [11].

Предполагается, что эозинофильные гранулоциты в опухолевой ткани желудка и толстого кишечника могут влиять на трансформированные клетки посредством продукции ростовых полипептидов, обеспечивающих самоподдержание, гиперпролиферацию и инвазивный рост опухоли, а также усиливающих процессы формирования в ней локальной сосудистой сети. Изучение механизмов межклеточной кооперации эозинофилов и опухолевых клеток позволит существенно дополнить современные представления о роли тканевой эозинофилии в патогенезе рака желудка и толстого кишечника.

Цель настоящего исследования - изучить особенности секреции ростовых факторов (VEGF и EGF) эозинофильными гранулоцитами крови in vitro и проанализировать экспрессию соответствующих рецепторов в опухолевой ткани у больных раком желудка и толстого кишечника с тканевой эозинофилией и без нее.

Материалы и методы

Работа проводилась в лаборатории клинической и экспериментальной патофизиологии кафедры патофизиологии СибГМУ (заведующий - д-р мед. наук, профессор, член-корреспондент РАН О.И. Уразова) и на базе патологоанатомического отделения ТООД (заведующий - д-р мед. наук И.Л. Пурлик). В исследование были включены 52 пациента с диагнозом рака желудка и 50 пациентов с диагнозом рака толстого кишечника (С18-С20), состоящих на диспансерном учете и проходивших лечение в ТООД (главный врач - С.В. Мазеина). Все пациенты были обследованы и прооперированы до назначения им специфической лучевой и лекарственной терапии. Диагноз рака желудка и рака толстого кишечника в каждом случае подтверждался результатами оценки клинического статуса пациентов и данных морфологического исследования. Пациенты с раком желудка и раком толстого кишечника были разделены на подгруппы в зависимости от наличия эозинофильной инфильтрации опухолевой ткани. В исследование вошли 25 пациентов со злокачественными новообразованиями желудка (средний возраст (65,3 ± 4,7) лет), в опухолевой ткани которых регистрировалась эозинофилия; 27 пациентов с раком желудка без эозинофилии (средний возраст (62,9 ± 5,2) лет); 23 человека (средний возраст (63,0 ± 7,3) лет) с диагнозом рака толстого кишечника, ассоциированного с тканевой эозинофилией; 32 пациента (средний возраст (61,3 ± 6,0) лет) с раком толстого кишечника, в опухолевой ткани которых не встречались эозинофилы.

В исследование не были включены пациенты, которым проводили предоперационную лучевую терапию и химиотерапию, а также пациенты с опухолями других локализаций, обострением хронических аллергических, аутоиммунных и инфекционных заболеваний. Группу контроля составили 36 здоровых доноров - 22 мужчины и 14 женщин (средний возраст (57,1 ± 3,3) лет).

Материалом исследования служили образцы тканей злокачественных опухолей желудка и толстого кишечника, супернатанты суспензионной культуры эозинофильных гранулоцитов. Исследование экспрессии рецепторов к фактору роста эндотелия сосудов (VEGFR) и эпидермальному ростовому фактору (EGFR) в опухолевой ткани желудка и толстого кишечника проводили иммуногистохимическим методом по стандартной методике [12] с использованием автоматического иммуногистостейнера Bond-maX (Leica Biosystems, Германия). В исследовании использовали антитела фирмы Novocastra (Leica Biosystems, Германия) к VEGFR - клон KLT9, рабочее разведение 1: 100, мышиные и EGFR - клон EGFR.25, RTU, мышиные. Анализ экспрессии в опухолевой ткани VEGFR и EGFR включал оценку относительного количества опухолевых клеток, имеющих на мембране указанные рецепторы [13, 14]. Производили подсчет не менее 300 клеток в областях с максимальной экспрессией рецептора.

Выделение эозинофильных гранулоцитов из цельной крови (взятой из локтевой вены утром натощак в количестве 20 мл) выполняли на градиенте плотности ficoll - paque (p = 1,077 г/мл) с применением Eosinophil isolation kit (Miltenyi Biotec GmbH, Германия) методом иммуномагнит- ной сепарации. Для стимуляции цитокин-секре- торной активности эозинофильных гранулоцитов крови в пробы вносили 10^-8 г/ мл рекомбинантного интерлейкина (r-IL) 5 (Biosource, Бельгия).

Концентрацию факторов роста VEGF и EGF в супернатантах суспензионных культур эозинофильных гранулоцитов измеряли иммунофер- ментным методом по протоколам фирмы-производителя тест-систем (RayBio, США). Оптическую плотность оценивали на фотометре-анализаторе Multiscan EX (Финляндия).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с применением программы Statistica for Windows Version 8.0 (StatSoft Inc., США). Для проверки соответствия выборочных данных нормальному распределению применяли критерий Шапиро - Уилка. Количественные признаки в группах сравнения представляли в виде среднего значения М и стандартного квадратичного отклонения о, а также медианы, верхнего (75%) и нижнего (25%) квартилей (Ме (Q₁-Q₃)). Достоверность различий независимых выборок, распределение которых не соответствовало распределению Гаусса, оценивали с использованием непараметрического критерия Манна - Уитни (U). Для проверки гипотезы о равенстве средних выборочных величин применяли однофакторный дисперсионный анализ (Е-критерий). Различия считали достоверными при уровне значимости р < 0,05.

Результаты

Основу патогенеза опухолевых заболеваний составляет кооперативное взаимодействие трансформированных клеток с элементами опухолевого микроокружения. Взаимное регуляторное влияние клеток внутри опухоли может быть обусловлено секрецией ростовых факторов и экспрессией их рецепторов. Сигнальные пути фактора роста эндотелия сосудов VEGF и эпидермального ростового фактора EGF имеют важное значение в формировании злокачественных опухолей желудка и толстого кишечника [10, 15, 16].

Источником ростовых факторов могут быть многие клетки опухолевого микроокружения [9, 11, 17]. По данным R. Shamri и соавт. (2010), тканевые эозинофилы способны экспрессировать VEGF при гипоксии в участках некроза опухоли [18]. Другими исследователями продемонстрирована высокая концентрация VEGF в сыворотке крови при раке толстого кишечника, раке молочной железы и почечно-клеточном раке [16, 19]. Высокая экспрессия VEGF в опухолевой ткани рассматривается в качестве негативного критерия прогноза течения болезни у больных раком легких и раком предстательной железы [20].

В настоящем исследовании у больных раком желудка и раком толстого кишечника мы оценивали секрецию сосудисто-эндотелиального фактора роста VEGF эозинофильными гранулоцитами крови in vitro в интактной культуре клеток и при добавлении в культуральную суспензию r-IL-5. Установлено, что базальная и индуцированная r-IL-5 секреция VEGF эозинофилами крови in vitro возрастала сравнительно с нормой только у больных раком желудка, сопровождающимся эозинофильной инфильтрацией опухолевой ткани. При этом у больных этой группы добавление r-IL-5 в культуру эозинофилов не сопровождалось увеличением in vitro секреции VEGF по сравнению с базальным ее уровнем (р > 0,05), что может свидетельствовать об истощении функционального резерва и (как следствие) низкой реактивности клеток (табл. 1). У пациентов с раком желудка без эозинофилии, а также у больных раком толстого кишечника с эозинофилией и без нее значения базальной и r-IL-5-индуцированной секреции VEGF эозинофильными гранулоцитами in vitro соответствовали контрольным значениям (см. табл. 1).

Т а б л и ц а 1

Секреция ростовых факторов в in vitro культуре эозинофильных гранулоцитов у больных раком желудка и толстого кишечника, пг/мл, Me (Q--Q₃)