Статья: 60 лет в строю: особенности молекулярной биологии озимой мягкой пшеницы сорта Безостая 1

Модуляция индекса стабильности специфической мРНК фактора элонгации трансляции eEF-1 проростков пшеницы под влиянием закаливающих температур

Увеличение трансляционной активности полисом под влиянием закаливающей температуры связано с возрастанием доли тяжелых полисом. Вместе с тем, стимуляция трансляционной активности полисом in vitro при поранении, холоде и гипоксии коррелирует с усилением экспрессии гена субъединицы фактора элонгации трансляции eEF-1 и его соответствующим накоплением в растительной клетке. Этот фактор играет центральную роль в элонгации полипетидных цепей эукариотических клеток, катализируя связывание аминоацил-тРНК с сайтом А на рибосоме, в ходе которого расходуется ГТФ. Помимо этого, для eEF-1 показаны ассоциация с цитоскелетом, связь с эндоплазматическим ретикулумом, участие в распаде белков и в организации митотического аппарата клетки.

Несомненно, фактор элонгации EF-1 играет важную роль в регуляции синтеза белка и изменение его содержания в той или иной ткани свидетельствует об изменении интенсивности синтеза белка [2, 27].

Известно, что стабильность мРНК определяется цис- и транс-факторами. Нестабильные мРНК имеют в составе молекулы (чаще всего в 3'-нетранслируемой области) последовательности нуклеотидов, определяющие их нестабильность (цис-фактор). К цис-факторам относится и длина поли-(А)-хвоста на 3'-конце мРНК. Транс-факторами выступают специфические РНКазы и другие белки, определяющие стабильность мРНК, в основном, через изменение цис-фактора - длины поли-(А)-хвоста. Есть основания полагать, что транс-факторами в ommp системе выступают магний-зависимые РНКазы ассоциированные с мРНК и устойчивые к действию традиционных депротеинизирующих агентов. С равной вероятностью, можно полагать, что таковыми факторами являются магний-зависимые рибозимные свойства самой РНК [23, 27].

Изменение стабильности некоторых мРНК в стрессовых условиях свидетельствует о широком диапазоне взаимного влияния цис- и транс-факторов. Была изучена степень полиаденилирования мРНК термальной ступенчатой хроматографией с колонки поли(У)-сефарозы и динамика эффективности молекулярной гибридизации поли-(А)+мРНК eEF-1 сортов озимой пшеницы Зимородок - высокоморозоустойчивый сорт и Безостая 1 - среднеморозоустойчивый сорт, в зависимости от времени инкубации в ommp системе водного препарата Mg++-содержащей РНК.

Сорт Безостая 1 имеет высокополиаденилированную и стабильную мРНК eEF-1 у контрольных проростков, растущих при 20оС. Закаливающая температура (4оС) вызывала у этого сорта деаденилирование (уменьшение на 40 % фракции длиннохвостовых молекул мРНК eEF-1) и дестабилизацию мРНК проростков.

У сорта Зимородок наблюдалась обратная картина: контрольные проростки имели относительно нестабильную мРНК eEF-1, которая резко стабилизировалась под действием закаливающей температуры и увеличивалась степень ее полиаденилирования (фракция мРНК eEF-1 с длинными поли(А)-последовательностями увеличивалась на 50 %) [2, 27].

По-видимому, эти факты во многом объясняют разницу в морозоустойчивости этих двух сортов: под влиянием закаливающих температур у морозоустойчивого сорта Зимородок резко увеличивается степень полиаденилирования мРНК фактора элонгации трансляции eEF-1 и ее стабильность, и как следствие этого возрастает синтез белка, что обеспечивает форсированное создание веществ и структур, обеспечивающих морозоустойчивость; сорт Безостая 1, по всей видимости, не способен к такой мобилизации белоксинтезирующего аппарата.

Поскольку эти данные имеют принципиальное значение исследования были расширены. Для этого оценку количества мРНК eEF-1 осуществляли тремя различными методами: гибридиацией олигодезоксирибонуклеотидного зонда, меченого радиоактивно (33Р) - 1) на колонке поли(У)-сефарозы (сэндвич-гибридизация); 2) в растворе и 3) методом ОТ-ПЦР с применением различных праймеров к кДНК этой ген-специфической мРНК. Все три метода дали вполне сопоставимые результаты (табл. 2).

Наибольшую разницу между двумя сравниваемыми сортами наблюдали при помощи метода сэндвич-гибридизации. Эффективность метода ОТ-ПЦР зависела от праймеров, взятых в исследование: использование праймеров с координатами ближе к 3'-концу молекулы мРНК повышало разрешающую способность метода определения стабильности в системе ommp с помощью ОТ-ПЦР.

Таким образом, представляется вполне обоснованным предположение о том, что ключевым моментом в молекулярном механизме адаптации растений к изменяющимся условиям среды являются процессы полиаденилирования и деаденилирования мРНК. Все экологические факторы: свет, температура, влажность и др. обуславливают изменения степени полиаденилирования мРНК в зависимости от генетической предрасположенности той или иной культуры, того или иного сорта. Несомненно, этот вывод требует обстоятельных доказательств, с привлечением самых современных средств изучения процесса полиаденилирования мРНК.

Таблица 2. Стабильность мРНК eEF-1? проростков пшеницы, определённая различными методами [27].

Распад мРНК в системе ommp и особенности биологии проростков пшеницы

Самым интересным фактом при наблюдении распада мРНК в системе ommp было то, что изменения ИС оказались не случайными, а отражали такие биологические особенности генотипа растений как стрессоустойчивость и фотопериодическая реакция. Это и навело впервые на мысль, что в ходе Mg++-зависимого распада в системе ommp c мРНК происходят превращения, подобные тем, что имеют место в живой растительной клетке.

Известно, что начальные этапы развития проростка, его фотосинтетическая деятельность тесно связаны с функцией фитогормонов и ингибиторов. Для этого периода важны физиологические данные по устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды, способности адаптироваться к ним, фотопериодическая реакция. На примере ряда озимых и яровых сортов пшеницы и ячменя установлено, что величина ИС мРНК прямо пропорциональна интенсивности роста проростков в оптимальных условиях роста [15, 18, 21, 27]. В дальнейшем было показано, что и для животных характерна такая же взаимосвязь между ростом и стабильностью мРНК [32, 33].

В частности, в таблице 3 представлены результаты исследования процентного выхода поли-(А)++мРНК из проростков озимых сортов пшеницы, которые росли при разных температурных режимах. Минимальный выход у всех сортов наблюдался при 20оС. При этом наблюдалось строгое соответствие величины индекса стабильности мРНК и интенсивности роста: сорт Безостая 1 лидировал по росту при этой температуре, сорт Краснодарская 39 замыкал ряд.

Таблица 3. Индекс стабильности мРНК четырехсуточных зелёных проростков озимой пшеницы при разных температурных условиях произрастания [15, 18, 27].

Отклонение от этой температуры приводило к увеличению процентного выхода поли-(А)++мРНК (увеличению индекса стабильности ИС). Интенсивность роста проростков увеличивалась с повышением температуры и была пропорциональна ИС. Т.е. при 26оС сорт Безостая 1 замыкал ряд по интенсивности роста, а возглавлял его сорт Краснодарская 39. Следовательно, и в этом случае увеличение ИС мРНК имело положительную взаимосвязь с ростом растений.

Исключением из этой закономерности являлось увеличение ИС суммарной мРНК, как и ген-специфической мРНК eEF-1 (табл. 2), при 4оС, когда проростки росли менее интенсивно, чем при 20оС. Увеличение процентного выхода поли-(А)++мРНК (повышение стабильности мРНК) в стрессовых условиях у проростков пшениц, вероятно, связано с тем , что наряду с торможением роста, необходимо поддержание относительно высокого уровня биосинтеза метаболитов для перестройки структуры клеток, обеспечивающей их устойчивость к стрессу.

Перед постановкой опытов растения выдерживали при освещении не менее 12 часов и опыт проводили на свету, так как наличие или отсутствие, а также длительность освещения сильно влияли на процентный выход поли-(А)++мРНК. Под воздействием света индекс стабильности мРНК Краснодарской 39, изначально более высокий, снижался в 3 раза, в то время как у Безостой 1 только в 1,2 раза (табл. 4).

Известно, что свет регулирует темп онтогенеза. Для озимой пшеницы характерна задержка роста под влиянием света, в то время как для яровой пшеницы это проявляется лишь в слабой степени. Важно подчеркнуть, что тип развития и продолжительность вегетационного периода неяровизированных растений определяется их реакцией на свет именно в начальный период жизни, т.е. на стадии проростков.

Таблица 4. Влияние света на индекс стабильности мРНК четырехсуточных зеленых проростков озимых сортов пшеницы при 20°С

Изменение скорости роста и развития влияет на такие важные свойства растений, как зимостойкость, засухоустойчивость, длину вегетационного периода (скороспелость и позднеспелость), неполегаемость, отзывчивость на удобрения и полив, величина урожая и его качество. Был отмечен важный факт: ранжировка селекционерами сортов озимой и яровой пшеницы по холодоустойчивости и засухоустойчивости в полевых условиях совпадают с оценкой, основанной на изучении изменения выхода поли-(А)++ мРНК из проростков, в лабораторных условиях [16, 27].

По-видимому, ИС мРНК отражает общие закономерности ростового метаболизма, характерные для как проростков, так и для взрослых растений. Изменение ИС мРНК коррелирровало с комплексной неспецифической устойчивостью растений к стрессам (табл. 5). Аналогичные закономерности для этих сортов и этих стрессов были описаны ранее по признаку увеличения прироста трансляционной активности полирибосом in vitro [5].

По-видимому, эти два явления объединяет третий фактор - дифференциальное, сортоспецифическое изменение длины поли-(А)-последовательности мРНК под влиянием света и закаливающей температуры. Эксперименты по сравнительному изучению трансляционной активности поли-(А)-содержащей мРНК с различной длиной терминальной поли-(А)-последовательности подтверждают это предположение - чем длиннее поли-(А)-хвост, тем выше трансляционная активность мРНК in vitro [27, 32, 33].

Таблица 5. Влияние холода, обезвоживания (ПЭГ) и засоления на индекс стабильности мРНК четырёхсуточных проростков озимой пшеницы

*ПЭГ - полиэтиленгликоль 6000

Оценка изменений относительной степени полиаденилирования мРНК

под влиянием закаливающей температуры при помощи двух методов - термальной ступенчатой аффинной хроматографии на колонке поли-(У)-сефарозы (табл. 6) и по степени гиперхромного эффекта отсечённого щёлочью от мРНК поли-(А)-хвоста (табл. 7) - показала существенное сортоспецифическое различие по этому параметру: резкое увеличение степени полиаденилирования мРНК у проростков сорта Краснодарская 39 и весьма незначительные (иногда обратные) изменения у Безостой 1.

Таблица 6. Влияние холода (4°С, 8 часов) на степень полиаденилироания мРНК проростков озимой пшеницы по результатам двух экспериментов методом термальной ступенчатой хроматографии на поли(У)-сефарозе

(A)n65°/(A)n35° - соотношение длинно и коротко хвостовых молекул

Таблица 7. Оценка длины поли-(А)-хвостов мРНК проростков пшеницы, полученных щелочным методом, по гиперхромному эффекту в опытах по влиянию низкой положительной температуры