Материал: 24 лекция - методы исследования

10

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Методы исследования можно разделить на две большие группы:

1. По объекту исследования

2. По задачам

По объекту исследования:

1. Методы исследования живых клеток и тканей

1. непосредственно в организме (in vivo)

2. в культуре клеток и ткани – в пробирке (in vitro)

3. суправитальное исследование

• суправитальное - исследование живых клеток, выделенных из организма

II. Методы исследования фиксированных клеток и тканей

1. светооптическая микроскопия

2. гистохимическое исследование - выявление в срезах

веществ разной химической природы (ДНК, РНК, гликоген,

импрегнация серебром, эластические волокна и т.д.)

3. иммуногистохимическое исследование – с применением

антител к исследуемым антигенам

4. электронно-микроскопические исследования - исследова-

ние клеточных ультраструктур

По задачам:

1. Качественные методы - выявление структур

Методы:

1. светооптический

2. электронно-микроскопический

3. гистохимический

4. иммуногистохимический

2. Количественные методы – изучение размеров или числа структур

Методы:

1. Морфометрический (количественная электронная микроскопия, количественная гистохимия)

2. иммунофенотипирование

3. цитогенетический

4. авторадиографический

5. ДНК-цитометрия

Светооптический метод (традиционная качественная гистология)

Две части:

1. приготовление гистологических препаратов

2. микроскопия гистологических препаратов

Этапы приготовления гистологических препаратов:

1. Врачебные

2. Лаборантские

Врачебный этап:

1. забор материала -

- максимально должен отражать изучаемый объект

(столько кусочков, сколько необходимо)

- как можно более свежий

- кусочек не более 1 куб. см

- щадящее - острый инструмент, не сдавливать

2. маркировка

- простым карандашом ФИО, № истории болезни

3. фиксация

- цель – предотвратить разложение ткани

- закрепить прижизненные структуры

- формалин - 10%, нейтральный

- объем фиксатора должен быть в 20-100 раз

больше фиксируемого кусочка

- время фиксации – не менее 12 часо до

нескольких суток (для иммуногистохими

- не более 24 часов)

2. Лаборантские

4. проводка материала

а. промывка - отмывают от формалина

• в проточной воде до 1 часа

б. обезвоживание

- обеспечивает проникновение парафина

• проводка по спиртам восходящей крепости до абсолютного спирта (от 60 до 100 градусов)

в. уплотнение - парафиновая заливка материала - заливка в расплавленный до 56 гр парафин

г. формирование блока

• когда парафин застыл, вырезают кусочек ткани

• насаживают на деревянную или пластмас-

совую основу

5. приготовление срезов

• на микротомах

1. санные

2. роторные (серийные срезы)

3. замораживающие (срочные исследования)

6. окрашивание среза

красители:

1. основные - структуры ими окрашивающиеся

называют базофильными (ядро – гематоксилином – в

фиолетовый цвет)

2. кислые - структуры ими окрашивающиеся

называются - оксифильными или ацидофильными

(цитоплазма – эозином – розовый цвет)

3. специальные

жир - судан Ш - оранжевый

эластические волокна - орсеином- коричневые

нервная ткань - соли серебра – черная

(импрегнация)

7. Заключение среза

задачи:

- сохранение среза, достигается:

- изоляция от внешней среды

• удаление воды (спирты)

реализация:

- капля канадского (пихтового) бальзама

- покровное стекло

Виды микропрепаратов:

1. гистологические срезы тканей органов

2. мазки (кровь человека)

3. отпечатки ( с опухоли)

4. пленки (РСТ)

Морфометрия

- метод определения числа и размеров структур

Разновидности:

1. ручная морфометрия

2. автоматизированная морфометрия

Виды морфометрических исследований:

1. подсчет индексов

2. измерение размеров структур

Индексы:

а. митотический индекс (ИМ) - число митозов на 100 (1000) клеток

б. индекс меченых ядер (ИМЯ)– при радиоавтографии – % клеток, включивших исследуемое вещество, меченое радиоизотопной меткой

г. статмокинетический индекс (СКИ) - накопление митозов в течение определенного времени после разрушения веретена деления (колхицин)

в. индекс апоптоза – частоты гибели клеток

Измерение размеров структур

1. окулярной микролинейкой (или окуляр-микрометра)

- позволяет получать абсолютные значения размеров

структур

- в мкм

2. морфометрических сеток

- позволяет определять относительные показатели –

долю объема, занимаемую структурой в срезе

- в %

Автоматизированные системы обработки изображений

Состоят из трех частей:

1. воспринимающая часть - сканирующий микроскоп

2. регистрация сигнала – фотометрический (ФЭУ) или видеокамера

3. ЭВМ (электронно-вычислительная машина) – цифровые массивы или гистограммы распределения изучаемого признака.

Задачи:

1. Морфометрическая - оценка морфометрических показателей (количество объектов в определенной площади среза, размеры объектов, отношения показателей). Регистрация сигнала - видеокамера.

2. Денситометрическая - оценка количества вещества в структуре (содержания ДНК в ядре клетки и т.д.). Регистрация сигнала – фотоэлектронный умножитель.

Пример морфометрической задачи - изучение ядерно-цитоплазматического отношения.

Ядерно-цитоплазматическое отношение –

- относительный показатель

- отношение объема (размера) ядра клетки к объему

(размеру) ее цитоплазмы

- является величиной постоянной (константой) для

каждого вида ткани

• константа достигается после окончания процесса

дробления в эмбриогенезе (процесс дробления

осуществляется до достижения клетками данной

ткани определенного ядерно-цитоплазматического

отношения, после чего начинается деление клеток

путем митоза)

- анализ показателя возможен только в пределах

одного вида клеток – т.е. невозможно сравнивать между собой лимфоциты и гепатоциты

Задачи исследования ядерно-цитоплазматического отношения:

1. оценка константы данной ткани

- лимфоциты – высокое ядерно-цитоплазма

тическое отношение (приближается к единице – малые лимфоциты – 0,9; средние – 0,7)

- гепатоциты – низкое ядерно-цитоплазматическое

отношение (0,45-0,55)

2. оценка функционального состояния клеток одной ткани

а. нормофункция - ядерно-цитоплазматическое

отношение, характерное для данной ткани,

константа – так в щитовидной железе тироциты

стенки фолликулов – однослойный кубический

эпителий

б. гиперфункция - сопровождается клеточной

гипертрофией – увеличением клеточных разме- ров за счет объема цитоплазмы, т.к. не происходит

изменений количества ДНК в ядре, а значит и

его размеров. Т.о. при гиперфункции ядерно-

цитоплазматическое отношение снижается,

становится более низким.

в. гипофункция - сопровождается клеточной

гипотрофией - атрофией - уменьшением

размеров клеток. При этом ядерно-цитоплаз- матическое отношение увеличивается.

Т.о. увеличение ядерно-цитоплазматического отноше-

ния в ткани свидетельствует о развитии гипофункции, а уменьшение - о

гиперфункции ее клеток.

Проточная цитометрия

- метод количественного анализа клеток в потоке несущей жидкости с

использованием проточных цитометров.

Основные принципы метода:

1. из ткани получают клеточную суспензию, состоящую из отдельных

клеток

2. клетки обрабатывают веществами, количественно связывающимися с

определенными клеточными структурами:

1. антитела – на белки в клеточной поверхности

2. ДНК-зонды

3. РНК-зонды и т.д.

3. использование флуоресцентной метки, присоединяемой к получаемому

комплексу

4. выстраивание клеток в потоке жидкости в один ряд, в одну линию

5. возбуждение флуоресцентных меток на клетках энергией лазера

6. измерение интенсивности люминесценции метки ФЭУ

7. обработка полученных результатов на ЭВМ

8. результаты исследований представлены в виде гистограмм распреде-

ления и вариационных рядов цифровых значений

Варианты:

1. количественная гистохимия

• измерение количества веществ в клетке с помощью

проведения химических реакций

- пример – ДНК-цитометрия

2. Иммунофенотипирование

- выявление комплекса антиген-антитело

ДНК-цитометрия

- изучение количества ДНК в ядрах клеток

Задачи:

1. оценка уровня активности пролиферативных процессов в ткани

2. распределение ядер клеток по плоидности

3. определение временных параметров клеточного цикла

4. выявление состояний анэуплоидии – отличающегося от нормального содержание ДНК

Окраска:

Люминесцентный краситель в реакции по Фельгену

Результаты исследования:

В виде ДНК-гистограмм - распределение изучаемых клеток по содержанию в их ядрах ДНК.

Три группы клеток:

1. диплоидные - содержание ДНК - 2с (хромосом – 2n)

2. промежуточные - 2с-4с

3. тетраплоидные - 4с

Т.о., клетки с определенным содержанием ДНК распределяются по периодам клеточного цикла следующим образом:

2с - характеризуют количество клеток в Go и G1 периодах

2с-4с - количество клеток в синтетическом периоде

4с - количество клеток в G2 и М-периодах цикла

Расчет величины пролиферативного пула клеток:

Клетки:

1. синтетическом,

2. премитотическом

3. митотическом периодах цикла

- чем выше его величина – тем выше скорость обновления ткани

наименьшая (стремиться к нулю) - в нейронах

наибольшая - гемопоэтическая и эпителий слизистой

пищеварительной трубки (до 50%)

Временные параметры митотического цикла:

- время прохждения периодов цикла

G1 – период - 3-10 часов

S - период - 7-10 часов

G2 – период - 2-3 часа

М- период - около 1 часа

Gо – период

А. всю клеточную жизнь - нейроны

Б. несколько часов - стволовые клетки

Иммунофенотипирование

- метод качественного и количественного определения наличия

исследуемых антигенов в клетках

Задачи:

1. изучение наличия на поверхности или внутри клеток рецепторных белков - антигенов

2. определение количества клеток, имеющих (экспрессирующих)

этот рецептор в исследуемой популяции

3. определение количества рецепторов на поверхности клеток

4. определение сочетания нескольких рецепторов на поверхности одной клетки (коэкспрессия)

Окраска:

Моноклональные антитела, меченные люминесцентной меткой

Моноклональные антитела позволяют выявлять дифференцировочные антигены на гемопоэтических клетках крови у человека и имеют маркировку CD (cluster of differentiation) - кластер дифференцировки: