Материал: Возбудитель ботулизма

Заболевания человека вызывают ботулотоксины типов A, B, E, а также F. В организме человека C. botulinum размножаются слабо и не продуцируют токсина за редким исключением. Ботулотоксин накапливается в пищевых продуктах, инфицированных спорами C. botulinum, при их прорастании, если созданы анаэробные условия (например при консервировании). Для человека ботулотоксин - самый сильнодействующий бактериальный яд, губительно действующий в дозе 10−8 мг/кг. Токсин представляет собой полипептидную цепь с одной или несколькими внутримолекулярными связями, его молекулярная масса равна 150 000, он относится к бинарным токсинам.

Ботулотоксины всех типов продуцируются в виде токсичных белковых комплексов, состоящих из нейротоксина и нетоксичного белка. Белок является стабилизатором токсина, защищает его от разрушающего действия протеолитических ферментов и HCl.

Ботулотоксин в виде высокомолекулярного комплекса малотоксичен и является прототоксином. В результате мягкого протеолиза, осуществляемого у большинства типов токсина собственными эндогенными протеазами, а у типа E экзогенными протеазами (например трипсином), прототоксин распадается на 2 субкомпонента: L-лёгкий и H-тяжёлый. Между ними сохраняется дисульфидная связь. L-суб-компонент соответствует фрагменту A (активатор) и оказывает токсическое действие на клетку-мишень (мотонейрон). H-субкомпонент соответствует фрагменту В (акцептор) и осуществляет прикрепление к рецептору клетки-мишени.

Ботулинический нейротоксин типа A-гемагглютинин комплекс используется в современной косметологии под торговыми названиями «Ботокс», «Диспорт» и «Лантокс».

Серологическая идентификация Clostridium botulinum основана на выявлении токсинов, по их структуре бактерии разделяют на 8 сероваров - А, В С_1(a), С_2(b), D, Е, F и G.

Антигенная структура бактерий остается малоизученной, показано наличие жгутиковых, группоспецифических (Н) и соматических, типоспецифических (О) Аг, не проявляющих токсических свойств. Оптимальная температура для токсинообразования вариабельна для бактерий типов А, В, С и D 35°С, для бактерий типов Е и F 28-30°С

1.6 Схемы бактериологической диагностики

·        Микроскопия:

а) методы окраски: простой метод, по Граму;

б) микрокартина: крупные палочки с закругленными концами, на концах споры, напоминающие «теннисную ракетку»;

Рисунок 2. Clostridium botulinum в препарате из культуры. Увеличение x900

в) грамположительные;

г) образуют споры;

д) не образуют капсулу;

е) подвижны.

·        Культивирование:

а) посев на питательные среды: МППБ, кровяной МПА;

б) особенности выделения возбудителя:

строгие анаэробы

оптимальная температура 37°С:

срок культивирования 48-72 ч;

для выделения чистой культуры возбудителя первичный посев прогревают в течение 1 ч при 80ºС и делают посев на кровяной МПА;

в) культуральные свойства:

на МППБ - помутнение среды; с газообразованием, с характерным запахом прогорклого масла;

на кровяном МПА - колонии крупные с корневидными отростками, с зоной гемолиза.

Рисунок 3. Clostridium botulinum на кровяном МПА - колонии крупные с корневидными отростками и зоной гемолиза

Выделение возбудителя проводят по общепринятой схеме. Лабораторному исследованию подлежат остатки пищевых продуктов, материал, полученный от больного, секционный материал. Кровь берут из вены пациента в количестве 5-10 мл и разводят 3-4% раствором цитрата натрия в соотношении 2:1, промывные воды из желудка забирают в объеме 50-100 мл, кал - 50-60 г. На секции забирают кусочки печени (50-60 г), отрезки кишечника и желудка и их содержимое. До поступления в лабораторию образцы хранят на холоде. Кровь исследуют только на наличие токсина с помощью биологической пробы на мышах (вводят 2 мл) или морских свинках (вводят 5-8 мл). Испражнения исследуют только на наличие возбудителя посевом на питательные среды, весь остальной материал - на наличие токсина и возбудителя. Банки с консервами выдерживают в термостате 10-12 суток, стерильно отбирают 50-100 г, растирают и центрифугируют, в надосадочной жидкости определяют токсин, в осадке - возбудитель. Мясо и рыбу обрабатывают спиртом и забирают пробы из внутренних частей (пробы рыбы рекомендуют брать от хребта и внутренних органов). Пробы изучают аналогично исследованиям консервированных продуктов.

.7 Основные морфологические, тинкториальные, культуральные и биохимические особенности микроорганизма

Морфология колоний. Строгий анаэроб, срок культивирования 48-72 часов. На МППБ - помутнение среды с газообразованием, характерный запах прогорклого масла. На кровяном МПА - колонии крупные с корневидными отростками и зоной гемолиза. На кровяном агаре с глюкозой образуют очень мелкие сероватые или мутные желтоватые колонии линзообразной формы (на различных средах у одного и того же штамма могут варьировать). Вокруг колонии образуются зоны гемолиза различной ширины. На печеночном агаре образуют полиморфные звездчатые колонии, на желатине - сероватые, окруженные зоной разжиженного желатина. На столбике агара можно обнаружить диссоциаты, R-формы имеют форму чечевичных зерен, S-формы - пушинок. Хорошо растут на жидких средах (обычно на бульоне Тароцци, бульонах из гидролизатов казеина, мяса или рыбы) при условии предварительного удаления О₂ из среды кипячением в течение 15-20 мин с быстрым охлаждением. Вызывают помутнение среды и газообразование, иногда имеется запах прогорклого масла, но этот признак непостоянен.

Все типы Clostridium botulinum образуют желатиназу, лецитиназу и Н₂S, проявляют широкий спектр сахаролитической активности (бактерии типов А, В, Е и F ферментируют глюкозу, левулезу, фруктозу, мальтозу и сахарозу типов С и D - глюкозу и мальтозу, тип G инертен к углеводам). Clostridium botulinum типов А и В обладают выраженными протеолитическими свойствами, разлагают свернувшийся яичный белок и гидролизуют желатин По биохимическим свойствам выделяют 4 группы.

Бактерии I группы проявляют выраженные протеолитические свойства, гидролизуют желатин и эскулин, ферментируют глюкозу и мальтозу, проявляют липазную активность на яичном агаре. Бактерии II группы проявляют сахаролитическую активность, но лишены протеолитической.

Бактерии III группы проявляют липазную активность и гидролизуют желатин. Бактерии IV группы гидролизуют желатин, но, в отличие от прочих возбудителей ботулизма не проявляют сахаролитических свойств и липазной активности, что послужило основанием для предложения выделить их в отдельный вид -Clostridium argentiense.

.8 Постановка биопробы

Экстракты из исследуемого материала фильтруют и делят на две части, одну из них прогревают 20-30 мин на водяной бане при 100^oС. Заражают фильтратом внутривенно или внутрибрюшинно двух белых мышей, морским свинкам вводят экстракт фильтрата подкожно. При наличии токсина ботулизма животные, зараженные некипяченым экстрактом фильтрата, погибают на 2-5 день с характерными клиническими признаками.

Рисунок 4. Биопроба на белой мыши

.9 Серологическая диагностика

Для обнаружения токсина применяют реакцию нейтрализации с ботулиническими диагностическими антитоксическими сыворотками. Сначала ставят реакцию с поливалентной сывороткой А, В, С, Е - двум белым мышам вводят внутривенно или внутрибрюшинно 0,5-0,8 мл исследуемого экстракта; другой паре мышей вводят смесь 0,5-0,8 мл экстракта с 0,2 мл поливалентной сыворотки (по 0,05 мл моновалентных сывороток типов А, В, С, Е). Перед введением смесь выдерживают в течение 30 минут при комнатной температуре. При наличии токсина погибают мыши, которым введен экстракт без сыворотки. После этого для определения типа токсина ставят развернутую реакцию нейтрализации с типоспецифическими диагностическими сыворотками А, В, С, Е. Для обнаружения возбудителей ботулизма производят посев в жидкие питательные среды. Каждый исследуемый материал засевают в два флакона емкостью 100 мл; один флакон прогревают на водяной бане 20 мин. при температуре 80°C.

Через 48 часов инкубации посевы исследуют на наличие возбудителей ботулизма путем микроскопирования и постановки реакции нейтрализации. Если результат исследования отрицателен, анализ культур повторяют на 6-10-е сутки роста. При обнаружении в посеве микробов, морфологически сходных с C. botulinum, и наличии токсина дают положительное заключение. Если в посевах обнаружены типичные микробы, но токсин отсутствует, следует провести активацию культуральной жидкости панкреатином или трипсином для выявления прототоксина C. botulinum типа Е. Чистую культуру возбудителей ботулизма выделяют путем посева на поверхность плотных сред или в высокий столбик агара и изолирования колоний с дальнейшей идентификацией культур с помощью реакции нейтрализации.

.10 Дифференциальный диагноз

Следует исключить сибирскую язву, бешенство, болезнь Ауески, листериоз, стахиботриотоксикоз, псевдочуму и болезнь Марека птиц, отравления растениями и солями свинца, послеродовой парез, воспаление головного и спинного мозга, и В-авитаминоз.

.11 Биопрепараты для лечения и профилактики

Лечение симптоматическое. Промывают желудок раствором двууглекислой соды, дают слабительные средства, применяют теплые клизмы, вводят глюкозу и кофеин, промывают ротовую полость раствором калия перманганата. В начале болезни хороший эффект даст внутривенное введение противоботулиновых антитоксических моно- или поливалентных сывороток в больших дозах (для лошади 600-900 тыс. ME).

Иммунитет при ботулизме антитоксический. С профилактической целью вакцинируют только норок. Применяют формолквасцовую анатоксин-вакцину и ассоциированную вакцину против ботулизма и пастереллеза.

Иммунитет наступает через 2-3 недели и продолжается не менее 12 месяцев. Антитоксическая сыворотка обладает выраженным профилактическим действием в течение 6-7 дней после их введения.

1.12 Устойчивость возбудителей к физическим, химическим и биологическим факторам

Споры C. botulinum весьма устойчивы к воздействию высоких температур: при 100°С они разрушаются лишь через 5 ч, 105°С через 2 ч, 120°С через 10 мин. Хороший обеззараживающий эффект достигается при комбинации гамма- и ультрафиолетового облучения. Химические соединения предотвращают прорастание спор.

Ботулинический токсин разрушается при кипячении в жидких средах через 15-20 мин, в плотных (мясо, рыба, корма) - через 2 ч. Токсин инактивируется также при доступе воздуха, азота или углекислоты, в резкощелочной среде (pH выше 8,5), при ионизирующем облучении и под воздействием прямого солнечного света. Протеолитические пищеварительные ферменты не разрушают токсин. В зерне он сохраняется более 3 мес.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, ботулизм - заболевание относится к токсикоинфекциям и характеризуется поражением ЦНС, параличами мышц глотки, языка, нижней челюсти и скелетных мышц.

Заболевание регистрируется во всех странах мира, в том числе и Республике Беларусь. Экономический ущерб складывается из высокого (до 95%) падежа животных.

Возбудитель - Clostridium botulinum - анаэроб, представляет собой грамположительную палочковидную форму микроба размером от 4-9х0,5-1,2 мкм, подвижную, токсико- и спорообразующую. При недостатке питательных веществ для его размножения рН выше 6, доступе кислорода он образует грамположительные, субтерминально крупные споры. Возбудитель ботулизма продуцирует 7 типов токсинов. Самый сильный из токсинов - нейротоксин, который образуется в условиях анаэробиоза.

К болезни восприимчивы животные многих видов, независимо от возраста. Наиболее часто заболевают лошади и норки. Дикие плотоядные устойчивы к заболеванию. Источником возбудителя инфекции является почва, навоз, вода, трупы контаминированные C. botulinum, из которых споры возбудителя попадают в корма и при благоприятных условиях прорастают, выделяя при этом токсин. Заражение животных происходит при попадании ботулинического токсина в пищеварительный тракт. Массовое заболевание животных происходит обычно в теплое время года, которое протекает спорадически, реже в виде энзоотий. Летальность - 70-95%.

Инкубационный период от нескольких часов до двух недель. Болезнь может протекать молниеносно, остро, подостро и реже - хронически.

У лошадей и крупного рогатого скота молниеносное течение характеризуется внезапной гибелью животных без каких-либо признаков болезни. Острое течение (длится от 1 до 4-х дней) проявляется беспокойством, снижением рефлекторной чувствительности, нарушением координации движений, гиперемией или желтушностью видимых слизистых оболочек. Наблюдается слюнотечение, паралич нижней челюсти и языка, который выпадает изо рта. Летальность 90-95%. При подостром (до 7 дней) и хроническом (до 3-4 недели) течениях болезни клинические признаки выражены слабее.

У овец отмечают нарушения координации движений, изгибание шеи, паралич языка и слюнотечение (при остром течении). Свиньи болеют редко. У них отмечают обильное слюнотечение, нарушения координации движений, слепоту, паралич жевательных мышц и глотки.

Во время заготовки и при хранении кормов не допускают попадания в них земли, трупов мелких животных, помета птиц. Запрещается скармливать животным заплесневелые и испорченные корма. При возникновении ботулизма больных животных изолируют и лечат. Убой их на мясо запрещен. Трупы (туши) с внутренними органами и шкурой уничтожают.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ботникова, Н. М. Классификация и номенклатура возбудителей бактериальных инфекций животных [Текст] / Н. М. Ботникова, Н.Б. Иванова. - Н. Новгород, 2009г. - 143с.;

. Ботникова, Н. М. Методы изучения морфологических особенностей бактерий и микромицетов [Текст] / Н. М. Ботникова. - Н. Новгород, 2009г.- 50с.

. Воробьев, А. А,- Медицинская и санитарная микробиология [Текст] / А. А. Воробьев, Ю. С. Кривошеин, В. П. Широбоков. - М.: «Академия», 2003г. - 464с.

. Госманов, Р.Г. Микробиология [Текст] /Р.Г. Госманов, А.К. Галиуллин, А.Х. Волков [и др.] - СПб: Лань, 2011г. - 490с.;

. Емельяненко П.А., Дунаев Г.В., Кудлай Д.Г. и др. Ветеринарная микробиология. - М.: «Колос», 1982.-304с.

. Зыкин, Л. Ф. Современные методы в ветеринарной микробиологии [Текст] / Л. Ф. Зыкин, 3. Ю.Хапцев , Т. В. Спирахина. - М.: Колос, 2008г. - 158с.

. Зыков, Л. Ф. Современные методы ветеринарной микробиологии [Текст] / Л. Ф. Зыкин, 3. Ю.Хапцев , Т. В. Спирахина. - М.: Колос, 2012г. - 108с.

. Колычев, Н. М. Ветеринарная микробиология и иммунология [Текст] / Н. М. Колычев, Р. Г. Госманов. -М.: Колос, 2003г. - 432с.

. Кисленко, В. Н. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии [Текст] / В. Н. Кисленко, - М.: Колос ,2005г. - 326с.

. Колычев Н.М., Госманов Р.Г. Ветеринарная микробиология и иммунология. - 3-е изд., перераб. и доп. М.: «КолосС», 2003. - 432с.

. Мишустин Е.Н., Емцев В.Т. Микробиология. - М «Агропромиздат», 1987. - 368с.