Влияние селеноорганических соединений на клинические и метаболические проявления у мышей линии ваlb/с при отравлении кобальтом
Л.Г. Ловцова, О.И. Гулий, Я.Б. Древко, С.В. Козлов, П.В. Смутнее
Актуальность и цели. Существенное воздействие на живые организмы и их сообщества оказывают техногенные поступления различных тяжелых металлов, включая кобальт. Целью нашей работы являлось изучение профилактической эффективности селеноорганических соединений (2,4-дифенил-тетрагидро- селенохромена и 2-фенил-4-(п-бром-фенил)-тетрагидроселенохромена) на модели острого отравления хлоридом кобальта у мышей линии ВЛТЬ/C.
Материалы и методы. Биохимические исследования при рассмотрении влияния двух селеноорганических соединений на метаболические показатели крови у мышей проводили на биохимическом анализаторе “StatFax 3300” с использованием диагностических систем фирмы «Ольвекс диагностикум» и «Диакон ДС». Для проверки правильности и точности определения биохимических показателей в сыворотке крови использовали контрольную сыворотку для биохимических исследований по ТУ 9398-022-09807247-2009, ООО “HOSPITEX DIAGNOSTICS”.
Результаты. В результате проведенных исследований установлено, что введение селеноорганических соединений (2,4-дифенил-тетрагидро-селено- хромена и 2-фенил-4-(п-бром-фенил)-тетрагидроселенохромена) препятствует развитию патологического процесса у мышей линии ВALb/c, вызванного воздействием завышенных доз ксенобиотика кобальта хлорида.
Выводы. Выяснено, что лучшие показатели по снижению интоксикации солями кобальта показывает 2-фенил-4-(п-бром-фенил)-тетрагидро-селенохромен предположительно из-за строения молекулы с введением ВГ в параположение, при котором электронная плотность смещается к ВГ и, как следствие, Se становится более реакционно-активным. Наряду с этим достоверно установлено, что оральное введение селеноорганических соединений (2,4-ди- фенил-тетрагидро-селенохромена и 2-фенил-4-(п-бром-фенил)-тетрагидро- селенохромена) в дозах 3,8 и 3,2 мг/кг клинически здоровым животным не оказывает негативного влияния на жизнедеятельность организма мышей.
Ключевые слова: кобальт, детоксикация, метаболизм, селеноорганические соединения, биохимический анализ крови, ксенобиотик, отравление тяжелыми металлами.
THE INFLUENCE OF SELF-ORGANIC COMPOUNDS ON CLINICAL AND METABOLIC MANIFESTATIONS IN MALE BALb/c LINES AT COBALT COVERAGE
L.G. Lovtsova, O. I. Guliy, Ya. B. Drevko, S.V. Kozlov, P.V. Smutnev
Background. A significant impact on living organisms and their communities is provided by man-made inputs of various heavy metals including cobalt. The aim of our work was to study the prophylactic efficacy of organoselenium compounds (2,4-diphenyl-tetrahydro-selenochromen and 2-phenyl-4-(p-bromo-phenyl)-tetrahydro- selenochromen) on the model of acute poisoning with cobalt chloride in BALb/c mice.
Materials and methods. Biochemical studies, when considering the effect of two organoselenium compounds on the metabolic parameters of blood in mice, were performed on a biochemical analyzer “StatFax 3300” using the diagnostic systems of the firm “Olvex Diagnosticum” and “Diakon DS”. To check the correctness and accuracy of the determination of biochemical parameters in serum, a control serum for biochemical studies was used in accordance with TU 9398-022-09807247-2009, LLC “HOSPITEX DIAGNOSTICS”.
Results. As a result of the conducted studies, it has been established that the introduction of organoselenium compounds (2,4-diphenyl-tetrahydro-selenochromene and 2-phenyl-4-(p-bromo-phenyl)-tetrahydroselenochrome) inhibits the development of the pathological process in BALb/c mice exposure to inflated doses of xe- nobiotic, cobalt chloride.
Conclusions. It was found that the best indices for decreasing intoxication of the salt of this metal shows 2-phenyl-4-(p-bromo-phenyl)-tetrahydroselenochrome. Presumably because of the structure of the molecule with the introduction of Br into the paraposition, at which the electron density is mixed with Br and, as a consequence, Se becomes more reactive. Along with this, it was reliably established that the oral administration of organoselenium compounds (2,4-diphenyl-tetrahydro- selenochrome and 2-phenyl-4-(p-bromo-phenyl)-tetrahydroselenochromes) at doses of 3,8 and 3,2 mg/kg, a clinically healthy animal does not have a negative effect on the vital activity of the mice.
Key words: cobalt, detoxification, metabolism, selenium compounds, biochemical blood test, xenobiotic, heavy metal poisoning.
Среди многих последствий хозяйственной деятельности человеческого общества особое значение имеет процесс прогрессирующего накопления металлов в окружающей среде. К наиболее опасным загрязнителям относят ртуть, свинец и кадмий. Существенное воздействие на живые организмы и их сообщества оказывают также техногенные поступления марганца, олова, меди, молибдена, хрома, никеля и кобальта. Кобальт нашел достаточно широкое применение в медицине. Для лечения анемии используются соли кобальта в сочетании с медью. Радиоактивный кобальт все чаще используется в онкологии в качестве заменителя радия.
В связи с вышеизложенным целью нашей работы являлось изучение профилактической эффективности селеноорганических соединений (2,4-ди- фенил-тетрагидроселенохромена [1] и 2-фенил-4-(п-бром-фенил)-тетрагидро- селенохромена [2]) на модели острого отравления хлоридом кобальта у мышей линии ВALb/c.
Материалы и методы
Для изучения детоксикационных свойств селеноорганических соединений было сформировано шесть групп мышей линии BALb/c по 10 особей в каждой. Возраст животных 8-12 недель, масса на начало эксперимента 18-25 г. Животных содержали в виварии согласно санитарным правилам и на стандартном рационе в соответствии с Постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 29.08.2014 № 51 «Об утверждении СП 2.2.1.3218-14 “Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)”». Корм представлял собой сухой брикетированный ПК-120 ГОСТ Р 51849-2011 Р.5 (ООО «Лабораторкорм», г. Москва). клинический метаболический отравление кобальт
Животные первой (фоновой) группы были интактными. Животным второй группы вводили 2,4-дифенил-тетрагидро-селенохромена в дозе 3,8 мг/кг, с кормом, однократно. Животным третьей группы вводили 2-фенил-4-(п-бром- фенил)-тетрагидроселенохромена в дозе 3,2 мг/кг, с кормом, однократно. Животным четвертой группы (положительный контроль) внутрижелудочно вводили токсин (кобальта хлорид) в дозе 200 мг/кг, что соответствует ЛД50. Пятой группе животных за 2 ч до введения токсина в дозе 200 мг/кг, с кормом давали 2,4-дифенил-тетрагидро-селенохромена в дозе 3,8 мг/кг. Шестой группе животных за 2 ч до введения токсина в дозе 200 мг/кг, с кормом давали 2-фенил-4-(п-бром-фенил)-тетрагидроселенохромена в дозе 3,2 мг/кг.
В течение 14 суток проводили наблюдение за общим состоянием и поведением животных; регистрировали гибель мышей, а также проявление симптомов интоксикации; отмечали особенности поведения, приема корма и воды; учитывали состояния волосяного покрова, слизистых и т.д.
Через 14 суток проводили умерщвление выживших животных методом транслокации шейных позвонков с последующим взятием биологических материалов. Кровь для биохимических исследований брали по 1-2 мл в вакуумные пробирки для in vitro диагностики “Improvacuter” (Guangzhou Improve Medical Instruments Co. Ltd, China) с использованием тромбина в качестве активатора сгустка. Для получения сыворотки пробы центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин.
Биохимические исследования проводили на биохимическом анализаторе “StatFax 3300” с использованием диагностических систем фирмы «Ольвекс диагностикум» и «Диакон ДС». Для проверки правильности и точности определения биохимических показателей в сыворотке крови использовали контрольную сыворотку для биохимических исследований по ТУ 9398-02209807247-2009, ООО “HOSPITEX DIAGNOSTICS”.
Результаты
Мыши подопытных групп отличались от контрольных животных по внешнему виду, по состоянию слизистых оболочек, активности, потреблению корма и воды, а также по естественным отправлениям.
В четвертой группе животных отмечалась ярковыраженная картина интоксикации: отказ от корма, нарушение груминга, вялость, гиподинамия, у большинства животных данной группы наблюдалось сопорозное состояние. Часть из них впадали в кому, после чего наступала смерть. Гибель животных в четвертой группе составила 40 %.
У животных пятой и шестой группы картина интоксикации была менее выражена и проявлялась снижением аппетита, гиподинамией, нарушением груминга. Через 7-8 суток после введение ксенобиотика (СоС12 в дозе 200 мг/кг) клинические симптомы интоксикации купировались, и далее мыши по внешнему виду не отличались от контрольных (фоновых). Во второй и третьей группе животных признаков интоксикации не наблюдалось.
Влияние исследуемых селеноорганических соединений можно проследить по суммарным данным биохимических показателей крови мышей. В результате биохимических исследований сыворотки крови экспериментальных мышей установлено достоверное повышение индикаторных ферментов печени - аспарагиновой и аланиновой аминотрансфераз у мышей третьей опытной группы (рис. 1). Данный факт указывает, что введение хлорида кобальта в дозе 200 мг/кг приводит к повреждению клеточных мембран гепато- цитов. В результате ферменты выходят в межклеточное пространство, откуда они поступают в кровь, где активность их резко возрастает.
Рис. 1. Активность ферментов в сыворотке крови мышей: АЛТ - аланиновая; АСТ - аспарагиновая аминотрансферазы
Вместе с этим в пятой и шестой группах животных, которым предварительно вводили селенорганические соединения, также отмечается достоверное повышение активности аминотрансфераз в сыворотке крови. Однако активность данных ферментов достоверно ниже, чем у мышей третьей опытной группы. Это объясняется тем, что селен, входящий в состав препаратов, обладает ярковыраженными антиоксидантными свойствами, что препятствует повреждающему действию ксенобиотика на мембраны гепатоцитов.
Наряду с этим введение хлорида кобальта в дозе 200 мг/кг приводит к повышению активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови животных четвертой, пятой и шестой групп. Однако активность данного фермента в группе с первым исследуемым селеноорганическим препаратом на 41 %, в группе со вторым препаратом на 47 % ниже, чем у мышей четвертой опытной группы.
Полученные данные свидетельствуют, что после однократного введения данных селеноорганических соединений при отравлении хлоридом кобальта фермент (щелочная фосфатаза (ЩФ)), который является катализатором биохимических процессов в клетках печени, при разрушении этих клеток попадает в кровь, увеличивая показатель ЩФ в крови в сравнении с контрольными данными в среднем на 45 %. В норме часть клеток обновляется, поэтому в крови обнаруживается определенная активность щелочной фосфатазы, что свидетельствует о гибели множества клеток как проявление отравления хлоридом кобальта.
Анализ показателей белкового метаболизма (мочевины и креатинина) в сыворотке крови мышей (рис. 2, 3) показывает, что однократное введение селенорганических препаратов не приводит к изменению данных показателей, которые находятся в пределах физиологической нормы (130-140 мкмоль/л) у мышей второй и третьей опытных групп. Вместе с этим введение кобальта хлорида в дозе 200 мг/кг приводит к достоверному снижению мочевины и креатинина в сыворотке крови животных, что говорит о нарушении метаболических процессов, сопровождающихся глубокими расстройствами белкового обмена в организме. Так, в четвертой группе мышей, которым вводили хлорид кобальта без предварительной премедикации концентрация креатинина и мочевины была ниже фоновых показателей на 62 и 73 % соответственно (54 ± 10,19 мкмоль/л и 2,02 ± 0,2 ммоль/л).
Снижение мочевины на фоне повышения трансаминаз и щелочной фосфатазы свидетельствует о глубоких нарушениях функциональной активности гепатобилиарной системы, вызванной токсическим воздействием хлорида кобальта. Известно, что печень обладает большими функциональными резервами, способность ее к дезаминированию и синтезу мочевины сохраняется при исключении из процессов обмена до 85 % ее ткани.
1 группа 2 группа 3 группа 4 группа 5 группа 6 группа (фоновая)
Рис. 2. Концентрация мочевины в сыворотке крови мышей
1 группа 2 группа 3 группа 4 группа 5 группа 6 группа (фоновая)
Рис. 3. Концентрация креатинина в сыворотке крови мышей
У мышей пятой и шестой групп, которым перед введением ксенобиотика (СоС12) вводили селеноорганические соединения, также наблюдается снижение концентрации креатинина и мочевины в сыворотке крови на 41 и 55 % - для креатинина и на 50 и 20 % - для мочевины (см. рис. 3). В то же время данные показатели достоверно выше, чем у мышей четвертой опытной группы. Данный факт свидетельствует, что селен препятствует повреждению мембран гепатоцитов ксенобиотиком.
Значительное повышение концентрации общего белка в крови мышей (рис. 4), которым вводили СоС12 без предварительной премедикации, по сравнению с фоновыми животными, обусловлено не только образованием патологических белков, но и обезвоживанием организма. Вместе с этим у животных пятой и шестой групп концентрация сывороточного белка достоверно ниже и составляет 91,243 и 127,667 г/л соответственно.
1 группа 2 группа 3 группа 4 группа 5 группа 6 группа (фоновая)
Рис. 4. Концентрация общего белка в сыворотке крови мышей
В ходе определения концентрации глюкозы в сыворотке крови животных опытных и контрольной групп (рис. 5) установлено достоверное увеличение данного показателя. Так, в четвертой группе мышей показатель глюкозы составил 9,9 ± 0,2 ммоль/л, что в 2 раза выше фоновых значений. Данный факт указывает на нарушение производной активности процесса гликогено- лиза у мышей (биохимического процесса расщепления гликогена до глюкозы, осуществляющегося главным образом в мышцах и печени). В итоге уровень сахара в крови резко возрастает, что обеспечивает приток энергии, необходимый для борьбы с отравлением токсическими дозами кобальта хлорида.
1 группа 2 группа 3 группа 4 группа 5 группа 6 группа (фоновая)
Рис. 5. Концентрация глюкозы в сыворотке крови мышей
Вместе с этим у животных пятой опытной группы, которым с профилактической целью вводили селеноорганическое соединение 2,4-дифенил- тетрагидро-селенохромена в концентрации 3,8 мг/кг, концентрация сывороточной глюкозы была также достоверно выше физиологических значений (8,6 ± 0,1 ммоль/л), но на 12 % ниже, чем у мышей четвертой опытной группы. Аналогичная динамика наблюдалась и у животных шестой опытной группы, которым до введения ксенобиотика применяли 2-фенил-4-(п-бром- фенил)-тетрагидроселенохромена в дозе 3,2 мг/кг. В данной группе животных концентрация сывороточной глюкозы составила 6,7 ± 0,2 ммоль/л. Это выше фоновых значений, но достоверно ниже, чем у животных четвертой и пятой опытных групп.