Влияние pH-статирования на антибиотические свойства молочнокислых бактерий Lactococcus lactis
Сультимова Т.Д.
Стоянова Л.Г.
Антимикробные свойства молочнокислых бактерий достигаются вследствие биосинтеза ими перекисей, молочной кислоты с последующим изменением уровня рН, а также биосинтеза веществ белковой природы - бактериоцинов. В настоящее время наиболее известным и разрешенным для использования в качестве биоконсерванта в пищевой промышленности является бактериоцин низин (код Е234), имеющий GRAS cтатус (Generally Recognized As Safe) с 1998 года, т.е. характеризуемый Европейским парламентом как безопасный. Однако известно, что биоактивность природных продуцентов антибиотических веществ низкая, антимикробный спектр действия низиноподобных веществ влияет на рост и развитие, в основном, грамположительных бактерии. Также известно, что эффективность действия низина снижается пищевом сырье от рН выше 5,0, возможна его инактивация протеолитическими ферментами. В связи с этим, исследователи изучают новые пути и способы биосинтеза антибиотических веществ, используя различные модификации известных бактериоцинов с наиболее активными антимикробными свойствами или же пытаются найти новые природные биоконсерванты [2, 3, 5].
В результате скрининга из коровьего молока, полученного в республике Бурятия, нами изолирован и изучен штамм 194, а методом слияния протопластов двух штаммов с низкой антибиотиксинтезирующей активностью получен высокоактивный штамм F-116. Эти штаммы обладали широким спектром антимикробного и фунгицидного действия, что является новым биологическим свойством для L. lactis ssp. lactis [1,2,3].
Для изучения свойств новых бактериоцинов были проведены исследования по влиянию ингибитора синтеза белка в клетке микроорганизма - левомицетина (100 мкг/мл), препятствующему переносу на рибосомы комплекса аминоацил-тРНК, на образование бактериоцинов изучаемыми штаммами лактококков. При замедлении роста микроорганизмов на 50-60% к концу активной фазы роста и переходе на стационарную фазу в питательной среде, содержащей левомицетин, синтез белка снизился на 70%, а антибиотическая активность культуральной жидкости уменьшилась на 80% - 90%.
Данные исследования дают основание считать, что биосинтез изучаемых бактериоциноподобных комплексов происходит с участием рибосом [2,3].
Результаты изучения их физико-химических свойств, спектральных характеристик позволили предположить, что синтезируемые новыми штаммами L. lactis ssp. lactis вещества, являются новыми уникальными бактериоциноподобными комплексами, ранее не описанными в литературе [1,3].
Биосинтез бактериоцинов - управляемый процесс: путем изменения условий культивирования продуцентов антибиотиков и прежде всего изменением состава питательной среды.
Одним из наиболее значимых параметров при культивировании L. lactis subsp. lactis с целью синтеза бактериоцинов является активная кислотность среды.
Изменение рН питательной среды влияет на активность ферментов микроорганизмов, состояние и число промежуточных продуктов биосинтеза, их диссоциацию, растворимость и другие свойства.
Необходимо подчеркнуть, что сильное подкисление и значительное подщелачивание питательной среды могут задержать развитие лактококков, остановить процесс образования бактериоцина.
В связи с этим, при подготовке питательной среды надо учитывать то, чтобы уровень рН среды по возможности остался в пределах необходимых для развития микроорганизма и биосинтеза антибиотических веществ значений. [3].
Считается, что оптимальным исходным значением рН для биосинтеза бактериоцинов является рН 6,6-6,8, но в процессе роста и развития лактококков значение уровень рН среды снижался до 3,8-4,2, а при таких условиях развития культуры (условия естественного закисления среды) большая часть образовавшегося бактериоцина (80-90%) выделяется в культуральную жидкость («свободный бактериоцин»), а меньшая его часть (10-20%) -- остается связанной с клетками лактококка[4].
Данное влияние может проявляться как результат непосредственного воздействия ионов водорода или гидроксильных ионов на клетку или как косвенное действие через изменение степени диссоциации веществ субстрата.
Изучение влияния рН-статирования ферментационной среды на синтез бактериоцина штаммами 194 и F-116 проводили в колбах (объем 450 мл) и в ферментере фирмы LKB (объем 5л) с автоматической стабилизацией уровня рН 1н раствором NaOH на уровне рН 5,9-6,0 при 30°С.
Таблица 1. Влияние рН-статирования на рост Lactococcus lactis ssp. lactis и синтез бактериоцинов штаммами 194 и F-116
Результаты контроля ферментационного процесса с автоматическим рН-статированием на уровне рН 6,0, показали, что при поддержании уровня рН при 5,9-6,0, исключающего течение автолитических процессов при закислении среды, накопление биомассы длилось до 9 часов у штамма F-116 и до 12 часов у штамма 194, что коррелировало с накоплением бактериоцинов в культуральной жидкости: уровень антибиотической активности штаммов повысился свыше 30%, (табл. 1). Количество NaOH, пошедшего на подтитровку, было максимальным после трех и до 9-12 ч ферментации, что соответствовало активному кислотообразованию.
Добавление СаСО3 как буферного агента в ферментационную среду в количестве 1,5 % увеличивало антибиотическую активность культуральной жидкости штамма 194 на 20%, дальнейшее увеличение концентрации вещества снизило накопления бактериоцина (табл. 2).
Таблица 2. Изменение антибиотической активности культуральной жидкости Lactococcus lactis ssp. lactis 194 на средах с карбонатом кальция
Таким образом, изменение pH питательной среды в большой степени оказывает влияние на биосинтез антимикробных веществ, образующихся в результате метаболизма молочнокислых бактерий. Стабилизация уровня рН в процессе ферментации позволило повысить уровень антибиотической активности культуральной жидкости примерно на 30%.
Литература
кислотность метаболизм микроорганизм биосинтез
1. Сультимова Т.Д., Стоянова Л.Г., Цыренов В.Ж. Биологический консервант на основе штамма Lactococcus lactis ssp. Lactis F-116//Вестник ВСГУТУ. - - № 5. - С. 91-96.
2. Стоянова Л.Г., Сультимова Т.Д., Ботина С.Г., Нетрусов А.И. Выделение и идентификация бактериоцинпродуцирующих штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis из свежего молока// Прикладная биохимия и микробиология. - 2006. - Т. 42. - № 5. - С. 560-568.
3. Стоянова Л.Г. Новые бактериоцины лактококков и их практическое использование: Автореф. дис. доктора биол. наук. - Москва, 2008. - 28 с.
4. Lu W. Nisin Production by Lactococcus Lactis Subsp. lactis under Nutritional Limitation in Fed-Batch Culture/W. Lu, W. Cong, Z. Cai // Biotechnology Letters. -2004. - № 3. - p. 235-238.
5. Daliй D.K.D., Deschamps A.M., Richard-Forget F. A review: Lactic acid bacteria- Potential for control of mould growth and mycotoxins// Food Control. - 2009. - 21 (4). - р. 370-380.