В экспериментальных исследованиях показано, что удаление продомена приводит к десятикратному увеличению сродства PCSK9 к рЛПНП и четырехкратному увеличению скорости деградации рЛПНП. Следовательно, продомен является важным фактором, который модулирует действие PCSK9 путем высвобождения каталитического домена [23, 24]. Высокая частота мутаций в области продомена у людей (34 %) при СГХС также свидетельствует о важности нормального аминокислотного строения продомена для обеспечения правильной (оптимально-необходимой) активности PCSK9 [25].
Strom T. B. et. al. (2014) установили, что в эндоплазматическом ретикулуме частицы пре-про-PCSO взаимодействуют с белковыми молекулами рЛПНП, которые также после синтеза на рибосомах находятся на стадии посттрансляционных модификаций. При этом рЛПНП способствуют аутокаталитическому отщеплению продомена от пре-про-PCSK9, а аутокаталитически расщепленный PCSK9 играет роль шаперона для нормального фолдинга белковых молекул рЛПНП [26]. Из этих данных следует, что некоторые межбелковые взаимодействия PCSK9 и рЛПНП, происходящие внутри клетки, являются взаимовыгодными.
Из эндоплазматической сети комплекс PCSK9-продомен транспортируется в аппарат Гольджи, при этом продомен, присоединенный к каталитическому домену, блокирует присоединение других белковых молекул, ингибирует ферментативную активность и защищает PCSK9 от расщепляющего действия других ферментов, в частности от фурина. Обнаружено, что из-за двух мутаций (А443Т и С679Х) устойчивость PCSK9 к действию фурина снижается, что уменьшает продолжительность жизни молекулы PCSK9. При этом концентрация PCSK9 в сыворотке крови и риск возникновения атеро-склероза снижены. Поэтому исследователи считают, что препараты, модулирующие действие фурина, могут оказаться полезными для терапии гиперлипидемии. При некоторых мутациях ^462Р, С679Х) нарушается фолдинг белка PCSK9 и его транспортировка из эндоплазматической сети к аппарату Гольджи [27, 28].
В комплексе Гольджи с PCSK9 взаимодействует белок сортилин. По мнению исследователей, сортилин необходим для транспортировки PCSK9 к клеточной мембране и последующей секреции в кровь. Основанием для подобного мнения послужило наличие тесной корреляции между плазменными уровнями PCSK9 и сортилина. Кроме того, у экспериментальных мышей с нокаутом гена сортилина SORT1, а также при использовании фармакологических ингибиторов сортилина плазменные концентрации PCSK9 снижались, в то время как при гиперэкспрессии SORT1 концентрация PCSK9 в плазме крови была повышена. Принимая во внимание корреляцию между PCSK9 и сортилином, авторы считают, что сортилин может также использоваться в качестве биомаркера [29]. У сортилиндефицитных животных также отмечалось снижение концентрации триглицеридов в печени и ослабление стеатоза. Таким образом, ингибиторы сортилина являются новым перспективным классом гиполипидемических средств, что нуждается в дальнейшем изучении и уточнении [30, 31].
Молекулярные механизмы регуляции биосинтеза PCSK9 установлены благодаря экспериментальным исследованиям на животных моделях и изолированных гепатоцитах человека. Центральным регулятором транскрипции гена PCSK9 является SREBP2.
Состояние голода и сытости, внутриклеточные концентрации холестерина являются решающими факторами в активации или угнетении SREBP2. В случае возникновения внутриклеточной гипохолестеринемии происходит активация SREBP2, который проникает в ядро клетки, где взаимодействует с промотором (область SRE1) PCSK9 и рЛПНП, что приводит к усилению транскрипции генов PCSK9 и рЛПНП [32-34]. Кроме того, SREBP2 активирует гены ферментов, катализирующих реакции биосинтеза и метаболизма холестерина: Р-гидрокси-Р-метилглутарил-КоА-синтаза (ГМГ-КоА-синтаза), 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА-редуктаза (ГМГ-КоА-редуктаза) (рис. 1). Высокохолестриновая диета, напротив, приводит к снижению экспрессии
PCSK9 в печени [35]. Данные механизмы регуляции направлены на поддержание внутриклеточного липидного гомеостаза.
Dubuc G. с соавт. обнаружили значительное влияние статинов на экспрессию PCSK9. Статины повышали уровни мРНК PCSK9 в человеческих гепатоцитах, при этом наблюдался дозозависимый эффект. При добавлении одного из предшественников холестерина - мевалоната (мевалоновой кислоты), происходило уменьшение экспрессии PCSK9. Механизм статин- индуцированного повышения PCSK9 авторы связывают с развитием внутриклеточной гипохолестеринемии и последующей активацией в данных условиях фактора транскрипции SREBP-2, который и усиливает экспрессию PCSK9 (рис. 1). Данное обстоятельство имеет важное клиническое значение, поскольку объясняет механизмы развития рефрактерности и слабой эффективности от проводимой статиновой терапии [36]. Так, увеличение дозы ста- тина в 2 раза не сопровождается пропорциональным (удвоенным) снижением сывороточных уровней ЛПНП. В клиническом исследовании Са1^кеу Н. Е. каждое удвоение дозы приводило к снижению концентрации ЛПНП только на 6 %: 10 мг аторвастина снижали уровни ЛПНП на 30 %, а при использовании 20 и 40 мг аторвастатина концентрация ЛПНП уменьшалась на 36 и 42 % соответственно [37].
Рис. 1. Механизм усиления экспрессии PCSK9 под действием статинов
Еще одним активатором транскрипции РС8К9, характерным, как правило, для печени, является НОТ-1а. В нескольких исследованиях сообщается, что статины стимулируют экспрессию НОТ-1а, который, в свою очередь, активирует транскрипцию гена РС8К9, что ведет к увеличению продукции белка РС8К9 [38, 39].
Из вышесказанного очевидно, что изучение этапов образования РС8К9, молекулярных механизмов регуляции биосинтеза РС8К9 имеет важнейшее значение. Необходимы дальнейшие исследования потенциальных мишеней для ингибирования РС8К9 и поиска биомаркеров для ранней диагностики атеросклеротического поражения.
На данный момент на стадии доклинических и клинических испытаний находятся группы препаратов, ингибирующие биосинтез PCSK9 на этапах транскрипции и постранскрипционных модификаций: антисмысловые нуклеотиды, малые интерферирующие РНК (миРНК), низкомолекулярные пептиды и др. [40].
Новые гиполипидемические препараты - ингибиторы PCSK9 - в силу своей способности угнетать статин-индуцированное повышение активности PCSK9 могут использоваться совместно со статинами, т.е. являются синерги- стами. В клинических исследованиях показана значительная эффективность ингибиторов PCSK9 и отсутствие побочных эффектов, свойственных стати- нам. В 2015 г. в США и странах Европы после успешного прохождения клинических испытаний для практического использования одобрено два препарата, которые являются моноклональными антителами против PCSK9: алиро- кумаб (Regeneron/Sanofi), эволокумаб (Amgen). В 2016 г. эти препараты разрешены в Российской Федерации. Они могут использоваться как в виде монотерапии (дополнение к диете), так и виде комплексной липидснижающей терапии (в дополнение к статинам/фибратам [41, 42].
Влияние PCSK9 на липидный метаболизм
Основная функция PCSK9 заключается в регуляции плотности (чис-ленности) рЛПНП на клеточной поверхности гепатоцитов, которые необходимы для элиминации избытка холестерина по маршруту: гепатоцит-желчь- кишечник-кал. Синтезированная молекула PCSK9 взаимодействует с рЛПНП на поверхности печеночных гепатоцитов с образованием комплекса PCSK9- рЛПНП, который потом погружается внутрь клетки посредством эндоцитоза. Дальше этот комплекс захватывается лизосомами и подвергается деградации. Чем выше концентрация/активность PCSK9, тем большее число рЛПНП под-вергнется деградации (инактивированию), что приведет к снижению численности рЛПНП на клеточной мембране гепатоцитов. Также есть предположения, что PCSK9, помимо деградации зрелых рЛПНП, нарушает образование рЛПНП на уровне посттрансляционных модификаций (в эндоплазматической сети и комплексе Гольджи) и на этапе транспортировки синтезированных рЛПНП к поверхности гепатоцита [43, 44].
Снижение плотности рЛПНП на плазматической мембране гепатоци- тов, опосредованное усиленной активностью PCSK9, сопровождается более длительной циркуляцией частиц ЛПНП в крови и возникновением гиперхолестеринемии. В таких условиях возникает дисбаланс между скоростью доставки холестерина в стенки сосудов и скоростью его уборки макрофагами- скевенджерами. В результате возникает перегруженность макрофагов холестерином, трансформация их в пенистые клетки, что является одним из ключевых моментов развития и прогрессирования атеросклеротического поражения сосудов. Помимо рЛПНП, мишенями для действия PCSK9 служат и другие рецепторы: рецептор липопротеинов очень низкой плотности (рЛПОНП) и лектиноподобный рецептор окисленных липопротеинов низкой плотности (LOX-1) [45-47].
PCSK9 способствует деградации рЛПОНП в гепатоцитах, фибробла-стах и нейроцитах. Roubtsova A. с соавт. (2011) исследовали роль PCSK9 в метаболизме жировой ткани. Мыши, нокаутированные по гену PCSK9, накапливали на 80 % больше жировой ткани, чем мыши дикого типа. Это свидетельствует о том, что PCSK9 регулирует уровни рЛПОНП в жировой ткани и ограничивает висцеральный адипогенез [45].
LOX-1 экспрессируется в моноцитах, сосудистых гладких миоцитах и играет важную роль в формировании пенистых клеток и миграции гладких миоцитов. У мышей, нокаутированных по LOX-1, уменьшается воспаление, снижается миграция макрофагов, что ослабляет течение атеросклероза. PCSK9 же, напротив, способствует повышенной активации LOX-1 и формированию атеросклероза [46, 47].
Учитывая взаимосвязь повышенных концентраций PCSK9 с гиперли-пидемией, рядом авторов обсуждали возможность использования PCSK9 в качестве диагностического маркера при атеросклерозе. Повышенные сывороточные уровни PCSK9 связаны с увеличенным риском возникновения ИБС [48, 49].
Almontashiri N. A. et al. (2014) сообщили, что плазменные уровни PCSK9 у пациентов с острым инфарктом миокарда выше, чем у пациентов с ИБС, но без инфаркта (363,5 ± 140,0 нг/мл против 302,0 ± 91,3 нг /мл, р = 0,004). Эти результаты свидетельствуют о том, что концентрация PCSK9 повышается либо перед инфарктом миокарда, либо во время инфаркта [50].
Cariou B. et al. (2017) в проспективном исследовании обнаружили, что у пациентов с ОКС (п = 174) сывороточные уровни PCSK9 связаны c тяжестью поражения коронарных артерий по шкале SYNTAX независимо от концентрации ЛПНП [51].
В недавнем исследовании показано наличие корреляции плазменных концентраций PCSK9 с субклиническими сосудистыми изменениями сонной артерии по данным ультразвуковой диагностики: толщиной интима-медиа, скоростью пульсовой волны и индексом жесткости р. Отсюда исследователи предполагают, что возможно использование PCSK9 в качестве биомаркера раннего сосудистого поражения до появления манифестного атеросклероза [52].
Нелипидные функции PCSK9
Некоторые исследователи направили свои усилия на изучение нелипидных эффектов PCSK9. На данный момент накоплено немало сообщений, свидетельствующих, что функции PCSK9 выходят за рамки регуляции метаболизма липидов. Ниже описываются наиболее значимые исследования, демонстрирующие наличие нелипидных эффектов у PCSK9, которые могут играть роль в патогенезе атеросклероза.
Li S. et а1. (2014) отметили ассоциацию между плазменными уровнями PCSK9 и количеством лейкоцитов (г = 0,167; р = 0,008) у пациентов (п = 251) со стабильной ИБС. При помощи многовариантного регрессионного анализа показано, что концентрация PCSK9 в плазме достоверно и независимо связана как с количеством лейкоцитов (Р = 0,217; р < 0,001), так и с их субпопуляциями (нейтрофилами - Р = 0,152; р < 0,05 и лимфоцитами - р = 0,241; р < 0,001). На основании этого авторы выдвинули предположение, что PCSK9 участвует в развитии хронического воспаления у пациентов с ИБС, которое, вероятно, играет роль в прогрессировании атеросклероза [53].
Экспериментальные исследования Walley K. R. et al. [54-56] свидетельствуют об участии PCSK9 в регуляции воспалительных реакций. Лабораторным мышам внутрибрюшинно вводили эндотоксин кишечной палочки [липо- полисахарид (ЛПС)]. При этом в группе мышей, нокаутированных по гену PCSK9, плазменные концентрации воспалительных цитокинов [интерлейкина-6 (ИЛ-6), фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-a), моноцитарного хе- мотаксического белка-1 (MCP-1)] были значительно ниже по сравнению с мышами дикого типа [54]. Снижение активности PCSK9 приводит к увеличению элиминации патогенных липидов (ЛПС), снижению воспалительного ответа, улучшению клинических показателей и выживаемости у септических мышей. Увеличение элиминации связывают со свойством ЛПС адсорбиро-ваться на частицах ЛПНП, которые затем транспортируются к рЛПНП печеночных гепатоцитов, откуда попадают в желчь, кишечник и удаляются из организма. Избыточная активность PCSK9 в данном случае уменьшает численность рЛПНП на гепатоцитах, что снижает клиренс ЛПС и способствует эн- дотоксинемии. Исследователи полагают, что блокирование PCSK9 может стать полезной терапевтической стратегией у пациентов c сепсисом и нуждается в дальнейшем изучении [55, 56].
В другом экспериментальном исследовании также показано, что повышенная активность PCSK9 усугубляет патологию многих органов, течение воспалительных (повышение концентрации воспалительных цитокинов) и гиперкоагуляционных состояний при сепсисе [57].
Ferri N. et al. (2012) сообщили о наличии экспрессии PCSK9 в гладких миоцитах сосудов и атеросклеротических бляшках человека. PCSK9, секре- тируемый гладкомышечными клетками, способен снижать экспрессию рЛПНП в макрофагах [58].
Учитывая, что PCSK9 способствует повышению концентраций воспа-лительных цитокинов (ИЛ-6, ФНО-а, MCP-1 и др.), играющих важную роль в этиопатогенезе атеросклероза, а также наличие экспрессии PCSK9 в атеросклеротической бляшке, весьма вероятно, что PCSK9 усиливает воспалительные реакции в атеросклеротической бляшке, а это является дополнительным патофизиологическим механизмом. Однако при всем этом подобные исследования немногочисленны и представляют только косвенные сведения об участии PCSK9 в патогенезе атеросклеротического воспаления.
Недавно Gencer B. с коллегами в крупном проспективном исследовании, включившем 2030 пациентов, установили, что концентрации PCSK9 связаны с концентрацией маркера острофазового воспаления (С-реактивного белка) и гиперхолестеринемией [59].
В крупном исследовании ATHEROREMO-IVUS представлены доказа-тельства прямого участия PCSK9 в патогенезе атеросклеротического воспаления. Пациентам провели внутрисосудистое ультразвуковое исследование с виртуальной гистологией и измерили концентрацию PCSK9 в сыворотке крови. Наблюдалась взаимосвязь между сывороточными уровнями PCSK9 и количеством ткани некротического ядра в пораженных атеросклерозом венечных сосудах независимо от сывороточных уровней холестерина, ЛПНП и использования пациентами статинов. Это говорит о том, что PCSK9 напрямую и независимо от параметров липидного спектра усиливает воспалительные реакции в атеросклеротической бляшке коронарных сосудов [60].