Несмотря на сложность и дороговизну, биохимическим методам принадлежит ведущая роль в диагностике моногенных наследственных болезней. Современные высокоточные технологии (жидкостная хроматография, масс-спектрометрия, магнитная резонансная спектроскопия, бомбардировка быстрыми нейтронами) позволяют идентифицировать любые метаболиты, специфические для конкретной наследственной болезни. Показаниями для применения биохимических методов диагностики у новорожденных являются такие симптомы, как судороги, кома, рвота, гипотония, желтуха, специфический запах мочи и пота, нарушения кислотно-основного состояния, остановка роста. Например, в случае фенилкетонурии применение биохимических исследований позволяет своевременно выявить патологию и начать специфические медицинские мероприятия. У детей биохимические методы используются во всех случаях подозрения на наследственные болезни обмена веществ (задержка физического и умственного развития, потеря приобретенных функций, специфическая для какой-либо болезни клиническая картина). Биохимические методы применяются для диагностики наследственных болезней и гетерозиготных состояний у взрослых (гепатолентикулярная дегенерация, недостаточность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы).
ГЛАВА 3. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МЕТОДЫ, ПРИМЕНЯЮЩИЕСЯ В МЕДИЦИНЕ
В совокупности с вышеперечисленными методами используются ещё несколько, более специфичных методик.
3.1 Дерматоглифика
Основное внимание в дерматоглифике уделяется папиллярным узорам так называемой гребешковой кожи ладоней и стоп человека. Как правило, особо выделяются узоры, расположенные на подушечках пальцев рук, к ним относятся следующие описательные понятия[5]:
· Трирадиус или дельта. Место схождения трёх групп параллельных папилярных линий.
· Гребешковый счёт. Количество папилярных линий от центра пальцевого узора до трирадуса.
· Дуга, петля, завиток. Виды пальцевых узоров. Дуге соответствует отсутствие трирадуса в узоре, петле -- один трирадиус, завитку -- два трирадиуса.
· Дельтовый индекс. Общее количество трирадусов на всех пальцах.
При описании признаков остальной ладони выделяются:
· Межпальцевый трирадиус. Признак, аналогичный пальцевым дельтам, расположенный между основаниями пальцев.
· Направление ладонных линий. Учитывается, на каком поле ладони заканчиваются папиллярные линии, начинающиеся от межпальцевых трирадиусов.
· Тенар (thenar) -- возвышение в основании большого пальца.
· Гипотенар (hypothenar) -- второе возвышение ладони, расположенное ниже основания мизинца.
· Осевой проксимальный ладонный трирадиус (t). Расположен близко к медиальной линии ладони.
При этом, при различных целях исследования, выделяются и описываются разные группы признаков.
Расоводиагностические признаки
Для исследования в области расоведения имеют значения пять основных признаков, перечисленных по мере снижения их важности:
· Индекс Каминса (Ic). Определяется по направлениям главной ладонной линии (начинающейся от основания указательного пальца) и линии, начинающейся от мизинца;
· Дельтовый индекс (Dl10);
· Осевой проксимальный ладонный трирадиус (t);
· Частота истинных узоров на гипотенаре (Hy);
· Процент добавочных межпальцевых трирадиусов (ДМТ);
Также ограниченно значим признак частоты истинных узоров на тенаре/первой межпальцевой подушечке (Th/I), дифференцирующий американских индейцев. Анализ родства человеческих популяций, как правило, производят сравнением комплексов упомянутых признаков[2].
Редкие признаки дерматоглифики
У человека насчитывается более 30 редких признаков дерматоглифики, которые используются в дисморфологии как информативные морфогенетические варианты, указывающие на возможность хромосомного дисбаланса, менделирующих мутаций или тератогенного эффекта у пробанда.
Метод наиболее информативен при хромосомных синдромах, когда выявляются дистальный осевой трирадиус, избыток дуг на пальцах, отсутствие дистальной межфаланговой складки, радиальные петли на I, IV и V пальцах, четырехпальцевая (обезьянья) складка (при болезни Дауна на коже ладоней у ребенка отмечается в 40-60% случаев.
В настоящее время метод применяется в основном в судебной медицине.
3.2 Метод выявления гетерозиготного носительства
Для человека, чье гетерозиготное состояние по тому или иному заболеванию установлено, чрезмерно важно не встретиться в браке с носителем подобного рецессивного гена, т.к. риск рождения у них больного ребенка составляет 25% как при первой, так и последующих беременностях.
Предположения о гетерозиготности женщины:
1) если у женщины поражен отец наследственной болезнью;
2) если женщина родила двух или нескольких пораженных сыновей;
3) если у женщины поражен брат (или братья), и, кроме того, она имеет пораженного сына или внука (от дочери);
4) если женщина имеет двух дочерей, причем у каждой из них родился пораженный сын (или сыновья).
Пути исследования:
1. Клиническое изучение микросимптомов заболевания с выявлением аномалий развития.
2. Использование нагрузочных тестов (прием фенилаланина выявляет повышение его содержания в крови - предположение о гетерозиготности по фенилкетонурии).
3. Микроскопическое исследование клеток крови и тканей.
4. Биологическое определение активности того или иного фермента, пострадавшего в результате мутации гена.
3.3 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Это экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе)[4].
Помимо амплификации ДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов.
ПЦР является одним из методов, который позволяет установить кариотип ребенка при использовании одной-единственной клетки. Биопсия материала для диагностики в сочетании с технологиями ПЦР проводится на 3-й день после оплодотворения, когда эмбрион содержит от 6 до 10 бластомеров. На этой стадии бластомеры являются полипотентными, и процедура биопсии не оказывает отрицательного влияния на жизнеспособность эмбриона. Оптимальным является анализ 1 - 2 бластомеров. В настоящее время биопсия бластомеров является современным подходом для пренатальной диагностики и может использоваться в клинической практике.
Эффективность ПЦР единственной клетки значительно ниже, чем обычной ПЦР, в которой количество ДНК-матрицы может быть в несколько раз больше. Снижение эффективности метода может происходить в результате разнообразных причин, касающихся как образца, так и самой процедуры ПЦР. К операционным проблемам относят потерю материала во время переноса клетки в пробирку или внезапный лизис до помещения клетки в пробирку, что снижает эффективность амплификации или приводит к ее отсутствию. Внутренние факторы заключаются в отсутствии ядра, дегенерации клетки с потерей или деградацией ДНК. Эти факторы контролировать значительно сложнее. На эффективность ПЦР, кроме процедуры переноса высококачественной ядросодержащей клетки, также влияет качественный лизис клетки с целью получения ДНК-матрицы.
Стратегии ПЦР, применяемые в ПГД
ПЦР с вложенными призерами
Для того, чтобы четко выявить ПЦР-продукт в геле с помощью окраски бромидом этидия или нитратом серебра, необходимо примерно 50 - 60 циклов ПЦР с уникальной последовательностью, хотя Taq-полимераза может начать "ошибаться" примерно после 40 циклов, в результате чего появляется неспецифический продукт. Решить эту проблему можно при использовании ПЦР с вложенными праймерами для увеличения чувствительности и специфичности ПЦР с единственной молекулы ДНК. Первый раунд ПЦР увеличивает количество анализируемого фрагмента ДНК, содержащего возможную мутацию. ПЦР-продукт (полученный в первом раунде) используется как матрица для второго раунда амплификации с другим набором праймеров, расположенным внутри первого фрагмента. Таким образом, увеличивается специфичность ПЦР. Использование двух различных наборов праймеров значительно снижает риск контаминации.
ПЦР с использованием флюоресцентно-меченных праймеров
ПЦР с использованием флюоресцентно-меченных праймеров (ПЦР ФП) по многим причинам в последнее время стала методом выбора, который широко используют в лабораториях для анализа ДНК единственной клетки. Использование лазерных систем автоматического анализа фрагмента, меченного различными флюоресцентными молекулами, во много раз увеличивает чувствительность выявления ПЦР-продукта по сравнению с окраской бромидом этидия или нитратом серебра, а также снижает риск контаминации. Автоматическая система четко фиксирует изменения размера полученного продукта даже в один нуклеотид. Кроме того, отпадает необходимость в долговременном электрофорезе фрагментов ДНК в полиакриламидном геле, поэтому анализ может быть проведен в кратчайшее время.
Полногеномная амплификация
В последнее время основным методом увеличения количества ДНК при анализе единственной клетки в ПГД является полногеномная амплификация (ПА). Использование этого метода позволяет значительно увеличить количество ДНК-матрицы, необходимой для проведения ПЦР. Наиболее часто используемый метод полногеномной амплификации - добавочная предамплификация (ДПА). При использовании этого метода случайные последовательности 15-нуклеотидных праймеров инициируют синтез геномной ДНК.
Недостатком ПА является то, что амплифицируется большое количество повторяющейся ДНК (короткие тандемные повторы), что дает некий "фон", который может приводить к ошибкам специфической ПЦР. Эти ошибки возникают в результате скольжения цепи ДНК во время полимеризации продукта, особенно при низких температурах, необходимых для этого метода. В связи с этим не рекомендуется использование полногеномной амплификации при клинической диагностике заболеваний, связанных с экспансией тринуклеотидных повторов, или при диагностике, основанной на анализе сцепления с высокополиморфными микросаттелитными повторами.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
На основании проделанной работы можно сделать вывод, что в настоящее время методы клинической генетики сложны и разнообразны. С их помощью можно диагностировать многие заболевания генного аппарата, выявить различные мутации на самых ранних сроках беременности и вовремя поставить вопрос о её прерывании, если диагностированная болезнь является серьёзной. Кроме того, при помощи клинической генетики можно не только диагностировать болезнь у одного конкретного человека, но и составить прогноз о появлении в его роду каких-либо наследственных болезней и дать некоторые рекомендации.
К сожалению, вынуждены признать, что у всех вышеперечисленных методов есть один существенный недостаток - их дороговизна. Биохимические методы чрезвычайно дороги в использовании, проводить ПЦР могут себе позволить лишь самые лучшие центры пренатальной диагностики. Существенная цена методов клинической генетики очень сильно влияет на их распространенность - и на политику государства в их отношении.
В нашей стране очень немногие люди могут себе позволить сделать какие-либо анализы, подобные вышеперечисленным. Поэтому часто для будущей матери оказывается сюрпризом, что её ребенок имеет серьёзное наследственное заболевание - и хорошо, если это выясняется во время беременности, а не уже после рождения ребенка.
Чтобы избежать таких ситуаций, нужно делать все, что возможно, чтобы снизить цену дорогостоящего генетического анализа. Тогда мы сможем с уверенностью сказать, что в нашей стране люди получают хорошую, а самое главное - современную, медицинскую помощь.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Е.К. Гинтер. Медицинская генетика. Учебник для студентов мед. вузов. Изд.: Медицина, 2003, с. 40-47.
2. Грин Н., Стаут У., Тейлор Д., Биология в 3-х томах. Москва, изд. Мир, 1990г.
3. Н.Н. Приходченко, Т.П. Шкурат. Основы генетики человека. Изд. Феникс, 1997г., с. 59-71.
4. Каледин А. С., Слюсаренко А. Г., Городецкий С. И. Биохимия. 1980. T. 45. с. 644-651.
5. Хить Г. Л., Долинова Н. А. Расовая дифференциация человечества (дерматоглифические данные). Москва, «Наука». 1990. с. 115-118.