Структура соединений V а-ч доказана на основании данных ИК, ЯМР 1Н и масс-спектров, а также качественных реакций с хлоридом железа (III).
2. Получение гидрохлоридов 1- (2-пиперазиноэтил) - и 1- (2-морфолино-этил) - 4-ацил-5-арил-3-гидрокси-3-пирролин-2-онов
С целью улучшения растворимости 1-гетерилалкил-4-ацил-5-арил-3-гидрокси-3-пирролин-2-онов в воде соединения I ж, з, и, о, II а и III б, в, з были переведены при упаривании на водяной бане в концентрированной хлороводородной кислоте в соответствующие соли VI а-д (выход 22,1-68,0%) и VII а-в (выход 78,3-91,2%).
Полученные соединения VI и VII представляют собой белые кристалли-ческие вещества, растворимые в воде, этаноле.
В ИК спектрах полученных гидрохлоридов VI а-д и VII а-в наблюдается полоса поглощения протонированной аминогруппы при 3395-3430 см-1 и при 3468-3616 см-1, соответственно. В спектрах ЯМР 1Н соединений VI а-д присутствует дополнительно к сигналам протонов соответствующих оснований сигнал одного протона протонированной третичной аминогруппы пиперазинового цикла при 8,34-8,37 м. д. и сигнал двух протонов протонированной вторичной аминогруппы того же гетероцикла при 9,80-9,93 м. д., а в спектрах соединений VII а-в сигнал одного протона протонированной третичной аминогруппы при 10,27-10,84 м. д. Соединения VI и VII дают реакцию на хлорид-ион с раствором нитрата серебра.
I ж, з, и, о; II а VI а-д
R1 = C6H5 (VI а, б), 4 - ClC6H4 (VI в, д), CH3 (VIг)
R2 = 4-Cl (VI а), 3-NO2 (VI б), 4-CH3O (VI в), H (VI г, д)
III б, в, з VII а-в
R = H (VII а), 4-CH3О (VIIб), 4 - Br (VII в)
3. Реакции 1-гетерилалкил-4-ацил-5-арил-3-гидрокси-3-пирролин-2-онов с нуклеофильными реагентами
В качестве мононуклеофильных реагентв были использованы п-толуидин и фенилэтиламин. Проведенные исследования позволили установить, что при кипячении 1- (2-морфолиноэтил) - 4- (4-метоксибензоил) - 5-арил-3-гидрокси-3-пирролин-2-онов III в, г в ледяной уксусной кислоте с п_толуидином были выделены 1- (2-морфолиноэтил) - 4-ацил-3- (4-толиламино) - 5-арил-3-пирролин-2-оны (VIIIа, б) (выход 68,6-81,8%).
III в, г VIII а, б
R=4-CH3O (VIIIа), Н (VIIIб)
Продукты реакции VIII а, б представляют собой светло-желтые кристаллические вещества, растворимые в диметилсульфоксиде, диметилформамиде и нерастворимые в воде.
В спектрах ЯМР 1Н соединений VIII а, б присутствует дополнительно к сигналам протонов соответствующих исходных соединений (III в, г) синглет трех протонов метильной группы пара-толильного остатка при 3,76 м. д., а также увеличивается интегральная интенсивность ароматических протонов. Структура подтверждается отсутствием качественной реакции с хлоридом железа (III) на енольную гидроксильную группу.
При кипячении 1 - [2- (индол-3-ил) - этил] - 4-ацетил-5-фенил-3-гидрокси-3-пирролин-2-она с фенилэтиламином в среде ледяной уксусной кислоты образуется 1 - [2- (индол-3-ил) - этил] - 4-ацетил-3-гидрокси-4- (1-фенилэтиламино-этилен) - 5-фенил-3-пирролин-2-он IX а (выход 72,1%).
IXа
Продукт реакции IX а представляют собой светло-желтое кристаллическое вещество, растворимое в диметилсульфоксиде, диметилформамиде и нерастворимое в воде.
В спектре ЯМР 1Н соединения IXа дополнительно наблюдаются 2 мультиплета четырех протонов метиленовых групп остатка фенилэтиламина в положении 4 при 2,81 м. д. и 3,58 м. д., сигналы 15 ароматических протонов бензольного кольца в положении 5 гетероцикла, индолильного кольца и фенильного кольца фенилэиламино-группы при 6,98-7,41 м. д.
В качестве бинуклеофильного реагента был выбран гидразингидрат. При взаимодействии его в эквимолярных количествах с 1-гетерилэтил-4-ацил-5-арил-3-гидрокси-3-пирролин-2-онами I д, II а, III г, д и V и-с, а также с 1- (2-пиперазиноэтил) - 4- (4-хлорбензоил) - 5-фенил-3-гидрокси-3-пирролин-2-она дигидрохлоридом VI д в ледяной уксусной кислоте получены 3,4-диарил-1,4,5,6-тетрагидро-6-оксо-5- (2-гетерилэтил) пирроло [3,4-c] пиразолы X а, б (выход 37,9-53,3%), XII а, б (выход 68,1-89,1%), XIV а-и (выход 72,3-93,2%) и дигидрохлорид XI а (выход 33,0%), соответственно.
Iд, IIа X а, б
R1= С6Н5 (Xа), СН3 (Xб); R2=4-CH3O (Xа), H (Xб)
VI д XI а
III г, д XII а, б
R1 = 4-CH3O (XIIа), Н (XIIб) R2=4-CH3O (XIIа), 4-Cl (XIIб)
V и-с XIV а-и
R1 = 4-FС6Н4 (XIVа-г), C6H5 (XIVд-з), 4-ClC6H4 (XIVи); R2 = 4-OH (XIVа, и), 3-OH (XIVб, ж), 3-CH3O4-OH (XIVв, з), R2C6H4=2-furyl (XIVг, е), R2C6H43-рyridyl (XIVи)
Синтезированные пирролопиразолы представляют собой белые (Ха, XII а, б, XIV а-и) или бесцветные (Хб, ХI а) кристаллические вещества, малорастворимые (Xа, Xб, XII а, б, XIV а-и) или растворимые (XIа) в воде, растворимые в этаноле, диметилсульфоксиде, диметилформамиде.
В спектрах ЯМР 1Н соединений дополнительно к сигналам соответ-ствующих исходных веществ присутствует уширенный сигнал протона при атоме азота пиразольного цикла, который наблюдается в области 12,5-14,0 м. д.
Соединения X, XI, XII и ХIV не дают качественную реакцию на енольный гидроксил с хлоридом железа (III), что наряду с данными спектров подтверждает их структуру.
Поскольку некоторые 3,4-диарил-1,4,5,6-тетрагидро-6-оксо-5- (2-морфолиноэтил) пирроло [3,4-c] пиразолы не удалось выделить в кристаллическом состоянии были получены их гидрохлориды XIII а, б (выход 68,4-79,3%) путем обработки соответствующих оснований хлористоводородной кислотой.
III а, б ХIII а, б
R = СН3 (XIII а), С6Н5 (XIII б)
Соединения XIII а, б представляют собой белые кристаллические вещества, растворимые в воде, этаноле, диметилсульфоксиде, диметилформамиде.
В спектрах ЯМР 1Н соединений ХIII а, б присутствует синглет протонированной вторичной аминогруппы морфолинового цикла при 10,23-10,52 м. д., сигнал протона при атоме азота пиразольного цикла сильно уширен и наблюдается в области 13-14 м. д.
Соединения ХIII а, б дают качественную реакцию на хлорид-ион с водным раствором нитрата серебра и не дают качественную реакцию на енольный гидроксил с хлоридом железа (III), что наряду с данными спектров подтверждает их структуру.
4. Биологическая активность синтезированных соединений
Фармакологические исследования проводились на кафедре фармакологии ПГФА к. б. н., асс. Шуклиной Н.С. под руководством д. б. н., проф. Колла В.Э. и д. м. н., проф. Юшкова В.В., на кафедре микробиологии ПГФА к. х. н., доц. Ворониной Э.В. и к. ф. н., доц. Винокуровой О.В. под руководством д. ф. н., проф. Одеговой Т.Ф., на кафедре физиологии и патологии ПГФА асс. Даниловой Н.В. и Егоровой А.О. под руководством д. м. н., проф. Сыропятова Б. Я.
Фармакологическому скринингу на наличие противомикробной, анальгетической, антидепрессивной, гемостатической и гипотензивной активности подвергнуто 56 соединений.
Противомикробную активность (ПМА) 45 синтезированных соединений в отношении St. aureus и E. coli определяли методом последовательных разведений в мясопептонном бульоне. Величина минимальной ингибирующей концентрации испытанных соединений по отношению к данным тест-микробам составляет 62,5-1000 мкг/мл. Результаты проведенных испытаний показали, что синтезированные соединения подавляют рост в гораздо большей степени золотистого стафилококка, нежели кишечной палочки. На величину ПМА синтезированных соединений влияет заместитель в арильном остатке в 5 положении гетероцикла. Так, относительно высокую активность показали вещества, содержащие в положении 5 гетероцикла 3-нитро-, 4-хлор-, 4-гидрокси - и 3-гидроксифенильный заместители.
Представляет теоретический интерес наличие высокой ПМА на уровне 62,5-125 мкг/мл относительно золотистого стафилококка и кишечной палочки у соединений Xа, XIIб, и XIVе, содержащих в своей структуре систему пирроло [3.4-c] пиразола.
Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать вывод о наличии у отдельных исследованных соединений ПМА, превышающей эффект этакридина лактата и фурацилина, и перспективности поиска соединений с высокой противомикробной активностью среди производных 1- (2-пиперазиноэтил) - 5-арил-4-ароил-3-гидрокси-3-пирролин-2-онов, 3,4-диа-рил-1,4,5,6-тетрагидро-6-оксо-5- (2-пиперазиноэтил) пирроло [3,4-c] пиразолов, 3,4-диарил-1,4,5,6-тетрагидро-6-оксо-5- (2-морфолиноэтил) пирроло [3,4-c] пира-золов и 3,4-диарил-1,4,5,6-тетрагидро-6-оксо-5 - [2- (3-индол-3-ил) - этил] пирро-ло [3,4-c] пиразолов.
Анальгетическая активность (АА) 24 синтезированных соединений изучалась по методу "уксусных корчей" в дозе 50 мг/кг. Проведенные исследования показали, что 11 изученных веществ проявляют АА, причем 7 из них (I д, е, ж, и, и V е, с, ц) незначительно уступают эталону сравнения метамизолу натрия, 4 соединения (V б, з, IVв и XIV б) превышают в 2-3 раза активность эталона сравнения. Таким образом, результаты свидетельствуют о перспективности поиска соединений с АА в ряду 1 - [2- (3-индол-3-ил) - этил] - 5-арил-4-ацил-3-гидрокси-2,5-дигидропиррол-2-онов, а 1,4,5,6-тетрагидро-3 - (4-фторфенил) - 4- (3-гидроксифенил) - 6-оксо-5 - [2- (3-индол-3-ил) - этил] пирроло [3,4-c] пиразол (XIV б) рекомендуется для проведения углубленных иссле-дований.
Антидепрессивная активность соединения I к была исследована в тестах “принудительное плавание” и “открытое поле”, вещество вводили внутрибрюшинно в дозах 10 мг/кг и 50 мг/кг за 30 мин до тестирования. Изучение антидепрессивного действия соединения I к показало, что в дозе 10 мг/кг соединение обладает более выраженными антидепрессивными свойствами, поскольку оно в 2 раза увеличивает первый период активного плавания, в 4 раза снижает количество иммобилизаций при сокращении среднего времени иммобилизации в 2,5 раза, а также увеличивает спонтанную двигательную активность и ориентировочно-исследовательское поведение в “открытом поле”.
Влияние на свертывающую систему крови. Водорастворимые соединения IIб, VIIб, в, Ха, XIа и XIIIа были испытаны на данный вид активности. Исследования проводились с помощью коагулометра "Минилаб 701" в концентрации 1 мг/мл. Обнаружено, что соединения VIа и Ха по гемостатическому действию превосходят препарат-эталон (этамзилат), т.к. повышают свертываемоть крови на 24,9 и 28,3%, соответственно, (этамзилат - 15,2%). Соединение XI а проявляет прямое антикоагулянтное действие, так как достоверно увеличивает время свертывания цитратной крови на 21,0%. Эталон сравнения гепарин замедляет свертывание на 22,4%.
Гипотензивную активность 1,4,5,6-тетрагидро-6-оксо-5- (2-пиперазино-этил) - 4-фенил-3- (4-хлорфенил) - пирроло [3,4-c] пиразола дигидрохлорида XI а, проявившего прямое антикоагулянтное действие, исследовали на наркотизированных кошках. Обнаружено, что соединение ХI а в дозе 5 мг/кг оказывает гипотензивное действие, снижая артериальное давление с 5 мин после введения, при этом гипотензивный эффект сохраняется на протяжении всего времени наблюдения (более 6 часов). Максимальное снижение давления наблюдается через 5-15 мин после введения и составляет 38,8-41,5%.
Определение острой токсичности синтезированных соединений показало, что они практически нетоксичны или малотоксичны по классификации Сидорова.
Выводы
1. Разработан общий метод синтеза 1-гетерилалкил-4-ацил-5-арил-3-гидрокси-3-пирролин-2-онов на основе трехкомпонентной реакции метиловых эфиров ацилпировиноградных кислот со смесью ароматического альдегида и гетерилалкиламина.
2. Впервые получены дигидрохлориды 1- (2-пиперазиноэтил) - 4-ацил-5-арил-3-гидрокси-3-пирролин-2-онов и гидрохлориды 1- (2-морфолиноэтил) - 4-ацил-5-арил-3-гидрокси-3-пирролин-2-онов, которые обладают значительно лучшей растворимостью в воде по сравнению с исходными основаниями.
3. Установлено, что реакция 1-гетерилалкил-4-бензоил-5-арил-3-гидрокси-3-пирролин-2-онов с ариламинами приводит к образованию 1- (2-гетерилалкил) - 4-ацил-3- (4-толиламино) - 5-арил-3-пирролин-2-онов.
4. При взаимодействии ариламинов с 1-гетерилалкил-4-ацетил-5-арил-3-гидрокси-3-пирролин-2-онами нуклеофильная атака осуществляется по карбонилу ацетильной группы и приводит к образованию 1-гетерилалкил-4-ацетил-3-гидрокси-4- (1-фенилэтиламиноэтилен) - 5-фенил-3-пирролин-2-онов.
5. Обнаружено, что при взаимодействии 1-гетерилэтил-4-ацил-5-арил-3-гидрокси-3-пирролин-2-онов и их гидрохлоридов с гидразингидратом в уксусной кислоте образуются 3,4-диарил-1,4,5,6-тетрагидро-6-оксо-5- (2-гетерилэтил) пирроло [3,4-c] пиразолы и их гидрохлориды.
6. Анализ результатов изучения противомикробной, анальгетической, антидепрессивной, гипотензивной активностей, влияния на свертывающую систему крови, а также острой токсичности свидетельствуют о том, что исследования среди производных 1-гетерилэтил-4-ацил-5-арил-3-гидрокси-3-пирролин-2-онов перспективны.
Рекомендации
1. Соединение 1,4,5,6-тетрагидро-6-оксо-5- (2-пиперазиноэтил) - 4-фенил-3- (4-хлорфенил) - пирроло [3,4-c] пиразола дигидрохлорид (XI а), обладающее одновременно гипотензивной и антикоагулянтной активностями при низкой токсичности, рекомендуется для проведения углубленных исследований с целью создания нового препарата.
2.1,4,5,6-Тетрагидро-3- (4-фторфенил) - 4- (3-гидроксифенил) - 6-оксо-5 - [2 (3-индолил) - этил] пирроло [3,4-c] пиразол (XIV б), который в 3 раза превышает анальгетическую активность эталона сравнения метамизола натрия рекомендуется для дальнейшего изучения в качестве анальгетического средства.
3. Производные 1- (2-пиперазиноэтил) - 5-арил-4-ароил-3-гидрокси-3-пирролин-2-онов, 3,4-диарил-1,4,5,6-тетрагидро-6-оксо-5- (2-пиперазиноэтил) пирро-ло [3,4-c] пиразолов, 3,4-диарил-1,4,5,6-тетрагидро-6-оксо-5- (2-морфолино-этил) пирроло - [3,4-c] пиразолов и 3,4-диарил-1,4,5,6-тетрагидро-6-оксо-5 - [2 (3-индолил) - этил] пирроло [3,4-c] пиразолов рекомендуются для углубленных исследований в качестве препаратов, обладающих противомикробным действием.