Статья: Разработка мягкой лекарственной формы с коллагеназой камчатского краба и перспективы ее применения

Разработка мягкой лекарственной формы с коллагеназой камчатского краба и перспективы ее применения

А.В. Локарев 1,

М.А. Огай 2,

Э.Ф. Степанова 2,

Ю.А. Морозов 3,

Н.Л. Нам 4,

А.И. Сливкин 5,

А.С. Беленова 5

1ФГБНУ "Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности"

2Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБОУ ВО ВолгГМУ 3ФГБОУ ВО "Северо-Осетинский государственный университет имени К.Л. Хетагурова" 4Российский Государственный Аграрный Университет - МС^ХА имени К.А. Тимирязева 5ФГБОУ ВО "Воронежский государственный университет"

Аннотация

Статья посвящена разработке оптимальной лекарственной формы протеолитического фермента на основе коллагеназы, для очищения пораженных тканей от детрита, экссудата.

Ферменты, широко применяются во многих отраслях, и особенно в последнее время, в сельском хозяйстве. Связано это с технологиями современного животноводства и птицеводства, а также возросшей потребностью новых кроссов и линий в питательных веществах и энергии. Одно из направлений - применение кормовых ферментов, активно развивающаяся линия в кормлении сельскохозяйственных животных, за последние годы показывающая активный рост. Использование ферментов может привести к снижению себестоимости конечного продукта.

Ферменты (энзимы) являясь белками, катализирующими биохимические процессы в организме (также относящиеся к протеолитическим ферментам) могут осуществлять расщепление белков в корме до пептидов, обеспечивая быстроту всасывания, а значит и насыщения животного.

Различные классы ферментов, таким образом, отвечают за многочисленные процессы в живом организме. Следовательно, и применение может быть весьма разнообразным, включая медицину, и фармацию. Такой диапазон использования ферментов может породить появление малоотходных технологий в их получении и использовании, в том числе при конструировании мягких лекарственных форм.

Данное направление, является актуальным, так как уже имеющийся ассортимент мягких лекарственных форм и ко сметиче ских средств не всегда приводит к желаемому успеху. В качестве основ рассматривались две - олеогель и карбопол. Биофармацевтические исследования показали большую активность коллагеназы, введенной в олеогель. Наиболее оптимальной оказалась 2% концентрация. С использованием ротационного вискозиметра для рассматриваемого олеогеля с коллагеназой при постоянном температурном режиме 20°С определены напряжение сдвига и вязкость; по полученным в ходе эксперимента расчетным данным построены "кривая вязкости" и "кривая течения", показывающие наличие петли гистерезиса и оптимального интервала вязкости. Сделан вывод о том, что разработанная мягкая лекарственная форма - олеогель с коллагеназой обладает выраженными тиксотропными свойствами.

Ключевые слова: коллагеназа, олеогель, карбопол, биофармация, детрит, экссудат, протеолитический фермент.

DEVELOPMENT OF SOFT DOSAGE FORM WITH KAMCHATKA CRAB COLLAGENASE AND PROSPECTS OF ITS APPLICATION

A V. Lokarev1, M. A. Ogai2, E. F. Stepanova2, Yu. A. Morozov3, N. L. Nam4,

A. I. Slivkin5, A. S. Belenova5

1Federal state budgetary scientific institution

all-Russian research and technological Institute of biological industry

2Pyatigorsk med~ical and pharmaceutical Institute-branch

of the Volgograd state med~ical University of the Ministry of health of Russia 3Federal state budgetary educational institution of higher education

"North Ossetian state Universi0. K. L. Khetagurova"

4Russian state Agrarian University - Mosco^w state agrarian

University named after K. A. Timiryazev

5Federal state budgetary educational institution of higher education

"Voronezh state University"

The article is devoted to the development of an optimal dosage form of a proteolytic enzyme based on collagenase for cleansing affected tissues from detritus and exudate.

Enzymes are widely used in many industries, and especially recently, in agriculture. This is due to the technologies of modern livestock and poultry farming, as well as the increased need for new crosses and lines in nutrients and energy. One of the directions is the use of feed enzymes, an actively developing line in the feeding of farm animals, which has shown active growth in recent years. The use of enzymes can reduce the cost of the final product.

Enzymes (enzymes) being proteins that catalyze biochemical processes in the body (also related to proteolytic enzymes) can carry out the splitting of proteins in the feed to peptides, providing fast absorption, and therefore saturation of the animal.

Different classes of enzymes are thus responsible for numerous processes in the living organism. Therefore, the application can be very diverse, including medicine and pharmacy. This range of use of enzymes can give rise to low-waste technologies in their production and use, including in the design of soft dosage forms.

This direction is relevant, since the existing range of soft dosage forms and cosmetics does not always lead to the desired success. Two bases were considered - oleogel and carbopol. Biopharmaceutical studies have shown greater activity of collagenase injected into oleogel. The most optimal concentration was 2%.

Using a rotary viscometer for the oleogel with collagenase under consideration at a constant temperature of 20C, the shear stress and viscosity were determined; according to the calculated data obtained during the experiment, a "viscosity curve" and a "flow curve" were constructed, showing the presence of a hysteresis loop and an optimal viscosity interval. It is concluded that the developed soft drug form - oleogel with collagenase has pronounced thixotropic properties.

Key words: collagenase, oleogel, carbopol, biopharmacy, detritus, exudates and proteolytic enzyme.

Для очистки ран от омертвевших тканей и лечения косметических дефектов, в настоящее время используют многочисленные ферментные препараты микробного, растительного и животного происхождения [1, 2]. До сих пор для очищения ран от денатурированного белка в виде присыпок или растворов широко используют различные протеолитические ферменты (трипсин, химотрипсин, протеолитин, панкреатин, дезоксирибонуклеаза, коллагеназа, стрептокиназа, дикиназа, траваза, аспераза, эстераза, панкепсин, эластолитин и другие). Следует отметить, что наиболее доступные ферменты (сериновые, цистеиновые и аспарагиновые протеиназы) являются малоактивными по отношению к коллагену [3]. Другим недостатком указанных видов протеаз является кратковременность их действия в ранах, в виду того, что они подвергаются расщеплению тканевыми и сывороточными ингибиторами. фермент коллагеназа рана

Мазей, содержащих ферменты, сравнительно мало. Наиболее широко в России распространена мазь Ируксол, которая оказывает лизирующее действие на некротические ткани и одновременно обеспечивает очищение ран от микроорганизмов. Эта мазь имеет определенные недостатки - и прежде всего, неудачная основа мази. Частично эти недостатки устранены в препарате Ируксол-моно, в состав которого входит аспераза, и поэтому он лучше разрушает фибрин. Известный также препарат Протегентин не нашел широкого применения в России и за рубежом в связи с тем, что при его создании была неудачно выбрана жировая основа. Видимые эффекты очищения чаще всего связаны с расщеплением под действием протеолитических ферментов фибрина, но не с разрушением коллагена. Поэтому более целесообразно применять препараты, обладающие коллагенолитической активностью [4].

Когда вопрос касается коллагена, активного строительного материала для косметических средств, то выбор соответствующей наружной формы для ферментной субстанции - очень значим.

Расщепление гнойного экссудата в ранах - злободневная тема. Причины могут быть разнообразны - инфекционный постхирургический процесс, "диабетическая стопа", пролежни, а также неудачные последствия косметических операций. Первым этапом комплексного лечения таких ран является использование ферментных препаратов, обладающих коллагенолитической, эластолитической и протеолитической активностью. Это известные препараты - карипазим, трипсин и химотрипсин. Вызывая деструкцию коллагена - основного компонента соединительной ткани, выше указанные препараты, оставляют интактными грануляционную ткань и эпителий. При гнойных ранах способствуют более быстрому очищению от нежизнеспособных тканей и экссудата, более раннему появлению грануляционной ткани и эпителизации. Предупреждают развитие грубых (типа келоидных) рубцов, способствуют сохранению функции поврежденной ткани. Однако, каждый из выше названных препаратов, обладает определенными недостатками. Так, карипазим, обладая резким запахом, не стабилен, при применении можно наблюдать разжижение препарата. Трипсин и химотрипсин можно использовать как присыпку, но более стабильный эффект возникает при дополнительных манипуляциях перед применением, а именно, растворяя 50 мг в 5 мл 0,9% раствора натрия хлорида, что не всегда удобно. Поэтому, расширение диапазона использования ферментных препаратов остается актуальной задачей.

Целью настоящей работы является выбор оптимального варианта использования протеолитического фермента с помощью нанесения его на кожу в виде мягкой формы - традиционной мази.

Предполагаемая мазь будет обеспечивать очищение пораженных тканей в ране и сглаживание грубых (типа келоидных) рубцов в косметологии.

Объекты и методы исследований

Коллагеназа (Collagenasum) - ферментный лекарственный препарат. Действующим компонентом препарата является фермент коллагеназа, обладающий протеолитической активностью с узко специфической направленностью к расщеплению коллагена с выделением свободной аминокислоты Т» оксипролиналагеназа. Коллагеназа является белком с аминокислотным составом, близким к составу коллагена; содержит 1% оксипролина и 7.5% пролина. Активность препарата выражается в единицах действия (ЕД). За 1 ЕД принимают количество коллагеназы, которое при определенных условиях выделяет из коллагена не менее 40% содержащегося в нем оксипролина; 1 г препарата соответствует 500 ЕД.

Для подтверждения возможностей использования коллагеназы и её эффективности нами были приготовлены мази на различных основах: в качестве таковых были использованы олеогель, на основе оливкового масло и аэросила [5]. Для второго варианта была взята одна из наиболее распространенных и востребованных на сегодняшний день гидрофильных основ - карбопол.

Однако, окончательный выбор вспомогательных компонентов, в данном случае мазевой основы возможен на основании биофармацевтического анализа высвобождения коллагеназы in vitro.

Для определения степени и скорости высвобождения коллагеназы из мягкой лекарственной формы выбран метод диффузии в агар. Изучали диффузию из каждого носителя в агаровый гель по следующей методике: в 100 мл 2% агарового раствора разливали в чашки Петри и оставляли для застывания при комнатной температуре на 30 минут. В сформировавшемся геле металлическим цилиндром (d = 6 мм) вырезали лунки, в которые помещали 0.3 г мази. Готовую систему оставляли на 24 часа в термостате при температуре 37 °С. Через 24 часа после внесения точной навески мази оценивали степень растворения агара вокруг лунки, что свидетельствовало о степени высвобождения действующего компонента.

Определение оптимальной концентрации коллагеназы в выбранной основе, проводили также методом диффузии в агаровый гель, фиксировали зону растворения агара, принимая самой оптимальной ту концентрацию, которая давала наибольшее растворение агара.

Карбополы - это товарная марка кросссополимеров на основе полиакриловой кислоты. Это полимерные загустители, в сухом виде макромолекулы кросс-сополимера содержат нейтральные СООН-группы и представляют собой свернутую беспорядочным образом пространственную сетку. Взаимодействие с водой приводит к гидратации молекулы, сетка растягивается и увеличивается в размерах (рН=3-4). Сетка занимает максимальный объем, связывая и загущая гидрофильный растворитель и растворы, позволяет создать привлекательный прозрачный продукт, сохранить прозрачность гелей, при введении в их состав различных компонентов. Карбопол дает стабильные основы, так как она не расслаивается, не высыхает, не комкается, не меняет цвет. Немаловажный технологический аспект - легок в применении: хорошо растворяется в воде, легко смешивается с любыми активными ингредиентами. Также одно из достоинств карбопола: высокая вязкость гелей при низких концентрациях полимера, термическая и микробиологическая устойчивость, стабильность и химическая стойкость при хранении, совместимость со многими активными веществами, возможность получения гелей с широким диапазоном рН от 4 до 10, легкость контроля вязкостных свойств получаемых гелей, способность стабилизировать эмульсии, гипоаллергенность, легкость нанесения и удаления с поверхности кожи, высокая абсорбция активных и лекарственных веществ. Оптимальный процент карбопола для получения гелевой структуры находится в интервале 0.1-1.6. Необходима нейтрализация щелочью. Гель останется стабильным при уровне рН от 5.5 до 8. К недостаткам карбопола можно отнести долгое время предварительного замачивания (до 12 часов), однако современные марки уже лишены этого недостатка.

Выбор основы при лечении мягкими лекарственными формами является зачастую - центральным звеном исследований [6, 7].

Реологические исследования. Перед заполнением анализируемой пробой контейнер циркуляционной ячейки адаптера APM тщательно протирался спиртоэфирной смесью 2:1 и высушивался на воздухе; образец мази выдерживался в течение получаса при температуре 20°С. Тип коаксиального шпинделя и объем исследуемой пробы мази подбирались согласно таблицам-приложениям к прибору и экспериментально. Анализ проводили с использованием 18 последовательно увеличивающихся скоростей вращения шпинделя (об/мин; восходящая).

Разрушение структуры изучаемого геля проводили путем вращения шпинделя в измерительном устройстве на максимальной скорости (100 об/мин.) в течение 10 минут, после чего, остановив вращение прибора на 10 минут, регистрировали показания индикатора (значение вязкости в mPa•sh) на каждой из 18 скоростей шпинделя при их уменьшении (нисходящая).

Измерения считали состоявшимися, только после того, как шпиндель совершал пять оборотов на заданной скорости в связи с тем, что для стабилизации показаний требуется некоторое время. Изучение реологических свойств мазей проводилось при строгом условии ламинарного течения жидкости [8, 9].

Механическую стабильность рассчитывали как отношение предела прочности структуры неразрушенной системы (л1) к величине предела прочности структуры системы, подвергнутой разрушению в течение 10 минут ўй).

Полученные в ходе эксперимента данные обрабатывались согласно Шрамм с использованием компьютерного обеспечения [10].

Результаты и их обсуждение

Для получения олеогеля было необходимым выбрать оптимальную концентрацию аэросила для загущения. Образец с содержанием аэросила 3% в оливковом масле представлял собой абсолютно прозрачную гомогенную систему с низкой вязкостью, но он подвергся синерезису, разделившись на два слоя: нижний -мутный (чуть более вязкий), составивший около 70% объема, и верхний - абсолютно прозрачный и практически жидкий как оливковое масло. Концентрация аэросила до 5% недостаточна для получения упруго-пластичной системы с оливковым маслом. Наиболее приемлемым для получения олеогелей для наружного применения нами выбрано 6%-е содержание аэросила.

Следующая основа для эксперимента - на основе карбопола (карбоксиполиметилена).

Таблица 1.

Мазевые основы с коллагеназой