Статья: Разработка и свойства нового носителя доксорубицина на основе поверхностно-модифицированных микрочастиц ноль-валентного железа с высокой эффективностью инкапсуляции и возможностью его контролируемого высвобождения

Использование ультразвукового (УЗ) излучения низкой частоты необходимо для инициирования высвобождения доксорубицина без повреждения структуры тканей организма. Описанное значение частоты УЗ излучения было использовано для демонстрации чувствительности исследуемой системы к внешним инициирующим воздействиям.

Эффективность инкапсуляции (ЭИ) определяли в соответствии с методом [21]. Расчет ЭИ проводили по формуле

где D_Т - теоретическая концентрация взятого для загрузки доксорубицина, D_ф - концентрация ДОКС после процесса инкапсуляции.

Концентрацию доксорубицина в образцах определяли методом УФ-спектроскопии при длине волны 480 нм. Для расчета концентрации использовали калибровочную кривую, которую строили по результатам измерения поглощения падающего света растворами доксорубицина в диапазоне концентраций 3,75-60 мкг/мл [22].

Влияние рН и поверхностной модификации на изменение ЭИ оценивали по следующей методике. Раствор ДОКС (1 мг/ мл, 1 мл) добавляли к суспензии ноль-валентного железа или Ее-СООИ (1 мг/мл, 1 мл). Полученную смесь перемешивали в течение 5 мин, затем центрифугировали при 14 000 об/мин в течение 15 мин. Образовавшийся супернатант отбирали для анализа. Для микрочастиц Ее-СБ определение ЭИ проводили в соответствии с описанной методикой, но с использованием смеси ДОКС/ТПП (2 мл, вместо раствора ДОКС). Смесь ДОКС/ТПП готовили в соответствии с разделом «Методика получения конъюгата Ее-СБ/ДОКС» и к суспензии микрочастиц прибавляли по каплям.

Влияние концентрации ДОКС на ЭИ изучали при pH = 5,5 по следующей методике. Раствор ДОКС объемом 1 мл с исследуемой концентрацией (0,4; 0,7; 1,0; 1,5; 2,0 мг/мл) добавляли к суспензии, содержащей ноль-валентное железо или Ее-СООИ (1 мг/мл, 1 мл). Полученную смесь перемешивали в течение 5 мин, затем центрифугировали при 14 000 об/мин в течение 15 мин. Образовавшийся супернатант отбирали для анализа. Для микрочастиц Ее-СБ определение проводили в соответствии с описанной методикой, но с использованием смеси ДОКС/ТПП вместо раствора ДОКС. Смесь ДОКС/ТПП готовили с использованием растворов доксорубицина с концентрациями (0,6; 1,05; 1,5; 2,25; 3,0 мг/мл) в соответствии с разделом «Методика получения конъюгата Бе- СБ/ДОКС» и к суспензии микрочастиц прибавляли по каплям.

Таблица

Методика изучения цитотоксичности. Определение цитотоксичности проводили с использованием клеточной линии ИеЬа (АТСС® ССЬ-2™). Выживаемость клеток т vitro определяли методом МТТ в соответствии со следующим протоколом [23]. Клетки культивировали в отдельных средах (2,5 х 10⁵ клеток/мл), содержащих микрочастицы железа ноль-валентного (Бе⁰), Бе-СООИ и Бе-СБ, соответственно, в течение 24, 48 и 72 ч. Среду, не содержащую микрочастиц, использовали в качестве контроля.

Суспензии анализируемых образцов микрочастиц с концентрацией 5-100 мкг/мл готовили непосредственно в среде. Удаление среды из каждой ячейки производили методом аспирации. Клетки в каждой ячейке промывали 200 мкл фосфатного буфера, а затем в каждую ячейку добавляли по 50 мкл раствора метилтиазолилтетразолия (МТТ) в концентрации 1 мг/мл. Спустя 2 ч инкубирования раствор МТТ удаляли путем аспирации и добавляли по 50 мкл изопропанола в каждую ячейку для растворения формазановых кристаллов. Оптическую плотность измеряли трижды для каждого образца при длине волны 595 нм с использованием многоканального считывателя (Тееап, Швейцария). Выживаемость клеток (%) рассчитывали как соотношение средних значений оптической плотности для каждого образца (I образец) иконтрольногообразца (I контроль).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе нами был проведен синтез микрочастиц железа, покрытых органическими функциональными группами. Для этого мы модифицировали ранее опубликованный метод [20], включающий в себя восстановление железа из соответствующего трихлорида борогидридом натрия в присутствии 4-карбоксибензолдиазоний тозилата. Для получения частиц микронных размеров мы использовали двухстадийное добавление трихлорида железа для роста частиц, и лишь потом добавляли раствор 4-карбоксибензолдиа- зоний тозилата для модификации. Размер полученных микрочастиц контролировали с использованием метода динамического светорассеивания (таблица).

Эксперименты по определению размеров микрочастиц железа (Бе⁰, Бе-СООИ и Бе-СБ) показали отсутствие значимой дисперсии результатов в ходе проводимых модификаций.

Отрицательное значение дзета-потенциала для микрочастиц Бе-СООИ объясняется присутствием на их поверхности карбоксильных групп. После дальнейшей модификации хитозаном происходит резкий сдвиг дзета-потенциала в положительную сторону, что, с одной стороны, объясняется появлением положительно заряженных аминогрупп, а с другой - уменьшением числа свободных карбоксильных групп за счет их участия в образовании амидной связи.

Полученные данные косвенно подтверждают ковалентную модификацию поверхности 4-кар- боксифенильными группами, а также вторичную прививку хитозана на поверхность. Данные факты также были подтверждены методом ИК-спек- троскопии (рис. 1).

Рис. 1. ИК-спектры микрочастиц Fe-COOH, Fe-CSи чистого хитозана

На спектре микрочастиц Ре-СООИ наблюдались пики поглощения при длинах волн V 2 974, 2 900 и v_С=О 1 689 см^-1, что указывает на присутствие карбоксильной группы (-СООИ). Поглощение при длинах волн v_СС 1 603 и 1 585 см^-1 подтверждает присутствие бензольного кольца. Таким образом, полученные результаты могут указывать на прививку 4-карбоксифенильных групп к поверхности микрочастиц [24].

Спектры микрочастиц Ре-СБ и хитозана сравнивали между собой. Спектр хитозана характеризуется наличием основных пиков поглощения ри длинах волн 3 350 см^-1, 2 870 см^-1(у_сн) и 1 060 см^-1 (у_{с 0 с}). На спектре микрочастиц Ре- СБ также присутствуют полосы поглощения при длинах волн 3 350 см^-1^_он), 2 870 см^-1^_сн). В результате чего можно сделать вывод о наличии хитозана в структуре микрочастиц Ре-СБ.

Изучение эффективности инкапсуляции и контролируемого высвобождения доксорубицина.

Рис. 2. Влияние рН и поверхностной модификации ДОКС (а) и концентрации ДОКС (Ь) на эффективность инкапсуляции

Результаты, представленные на рис. 2, а, демонстрируют положительное влияние поверхностной модификации на ЭИ доксорубицина. Присутствие карбоксильных групп (-СООН) на поверхности микрочастиц значительно увеличивает эффективность инкапсуляции (более 25%) по сравнению с немодифицированными микрочастицами (Ре⁰). Более того, благодаря дальнейшей модификации поверхности (присоединение хитозана), эффективность инкапсуляции была увеличена до 90%, что делает систему Ре-СБ подходящей для использования в качестве носителя лекарственных средств. Данное явление может быть объяснено следующим образом: молекулы доксорубицина из-за наличия положительно заряженных аминогрупп вступают в электростатические взаимодействия с карбоксильными группами микрочастиц Ре-СООН. Связывание компонентов усиливается благодаря появлению водородных связей [12].

В системе Ре-СБ присоединение ДОКС также осуществлялось благодаря электростатическим взаимодействиям. За счет большого числа положительно заряженных аминогрупп в молекуле хи- тозана происходит увеличение емкости загрузки отрицательно заряженных молекул, что, в свою очередь, приводит к увеличению ЭИ. Поскольку молекула ДОКС несет положительный заряд, ее присоединение к микрочастицам Ре-СБ происходит с использованием отрицательного заряженного кросс-линкера (ТПП) в виде комплекса ДОКС-ТПП. Более того, повышение ЭИ может быть связано с увеличением числа водородных связей. Подтверждено влияние рН на ЭИ.

В эксперименте было показано последовательное уменьшение ЭИ при увеличении значений рН. Для микрочастиц Ре-С00Н при увеличении рН с 3,3 на 5,5 ЭИ снижалась на 11%. При более сильном увеличении (с 3,3 на 7,4) ЭИ уменьшалась на 18% (см. рис. 2, а). Это объясняется за счет депротонирования функциональных групп (-№Н⁺³ и -С00Н), что, в свою очередь, приводит к изменению их зарядов и ослаблению электростатических взаимодействий.

В системе Ре-СБ также наблюдалось снижение ЭИ с увеличением значения рН за счет уменьшения прочности электростатических взаимодействий между функциональными группами ДОКС, хитозана и ТПП. В данном случае, благодаря присутствию гидрофильного покрытия (хитозана), происходит увеличение числа водородных связей, что повышает стабильность конъюгата.

На рис. 2, Ь, представлена оценка влияния концентрации доксорубицина в реакционной смеси на эффективность инкапсуляции. В случае микрочастиц Бе⁰ наблюдалось стабильное уменьшение ЭИ после ее начального снижения. При концентрации ДОКС 0,5 мг/ мл было достигнуто равновесие между процессами адсорбции-десорбции (ЭИ = 5%), о чем свидетельствует дальнейшее последовательное снижение ЭИ при увеличении концентрации ДОКС.

В случае микрочастиц Бе-СООН и Бе-СБ наблюдалась похожая тенденция, но в отличие от Бе⁰ снижение наблюдалось на всем диапазоне исследуемых концентраций. В результате полученные данные подтверждают влияние поверхностной модификации на эффективность инкапсуляции. Также в ходе проведения эксперимента было установлено значение емкости загрузки, которое составило 0,9 мг доксорубицина на 1 мг микрочастиц Бе-СБ.

Оценку возможности контролируемого высвобождения доксорубицина из системы Бе-СБ про водили в эксперименте invitroпод воздействием УЗ-излучения при последовательном изменении значений рН.

Полученные в ходе эксперимента результаты (рис. 3) подтверждают влияние УЗ-излучения на скорость высвобождения терапевтического агента вне зависимости от рН среды. Такое влияние объясняется появлением кавитационных пузырьков в среде высвобождения при воздействии на нее ультразвука. Их дальнейшее разрушение приводит к появлению градиента сдвига, который, в свою очередь, вызывает растяжение и разрыв химических связей [25]. Присоединение компонентов системы, в том числе и терапевтического агента, происходит за счет электростатических взаимодействий, которые являются менее прочными, чем химические связи. В результате постепенное растяжение приводит к их разрушению и ускоренному высвобождению доксорубицина. Таким образом, для исследуемой системы была подтверждена возможность контролируемого высвобождения доксорубицина.

Рис. 3. Высвобождение доксорубицина из конъюгата Fe-CS/DOX: по оси ОХ - время, ч; по оси OY-

Исследование цитотоксичности. Результаты изучения цитотоксичности микрочастиц представлены на рис. 4.

Из диаграммы видно, что значения выживаемости клеток в присутствии различных концентраций исследуемых микрочастиц не отличаются от значений, наблюдаемых в контроле (значения с концентрацией микрочастиц 0 мкг/мл), что свидетельствует об отсутствии самостоятельных цитотоксических свойств разрабатываемой СДЛС (при отсутствии нагруженного химиотерапевтического агента).

Рис. 4. Выживаемость клеточной линии HeLaв присутствии микрочастиц Fe⁰(я), Fe-COOH(b) и Fe-CS(c) в зависимости от их концентрации и времени культивирования клеток

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований был разработан способ получения СДЛС (Fe-CS/ ДОКС) на основе микрочастиц ноль-валентного железа с ковалентно присоединенным к поверхности хитозаном. Изучена эффективность инкапсуляции химиотерапевтического агента (док- сорубицина) и определена емкость его загрузки (0,9 мг на 1 мг микрочастиц Fe-CS). Установлены значения контролируемого высвобождения док- сорубицина из конъюгата Fe-CS/ДОКС за 12 ч под воздействием ультразвукового излучения при различных значениях рН в эксперименте invitro(58,8% под воздействием ультразвукового поля и 46,1 без его воздействия). Отсутствие цитотоксичности полученных микрочастиц было подтверждено в эксперименте invitroна клеточной линии HeLa (ATCC® CCL-2™) для всех образцов (Fe⁰, Fe-COOHи Fe-CS) вне зависимости от их концентрации.

ЛИТЕРАТУРА

1. Liu F.S. Mechanisms of chemotherapeutic drug resistance in cancer therapy - A quick review. Taiwan J. Obstet. Gynecol. 2009; 48 (3): 239-244. DOI: 10.1016/S1028- 4559(09)60296-5.

2. Wang D., Zhou J., Shi R., Wu H., Chen R., Duan B., Xia G., Xu P., Wang H., Zhou S., Wang C., Wang H., Guo Z., Chen Q. Biodegradable core-shell dual-metal-organic-frameworks nanotheranostic agent for multiple imaging guided combination cancer therapy. Theranostics. 2017; 7 (18): 4605-4617. DOI: 10.7150/thno.20363.

3. Jain R.K., Stylianopoulos T. Delivering nanomedicine to solid tumors. Nat. Rev. Clin. Oncol. 2010; 7 (11): 653-- 664. DOI: 10.1038/nrclinonc.2010.139.

4. Palumbo M.O., Kavan P., Miller W.H. Jr., Panas- ci L., Assouline S., Johnson N., Cohen V., Patenaude F., Pollak M., Jagoe R.T., Batist G. Systemic cancertherapy: achievements and challenges that lie ahead. Front. Pharmacol. 2013; 4 (57): 1-9. DOI: 10.3389/ fphar.2013.00057.

5. Sak. K. Chemotherapy and dietary phytochemical agents. Chemotherapy Research and Practice. 2012; 2012: 282570. DOI: 10.1155/2012/282570.

6. Prasanna N.R., Triveni C., Soumya R., Ramana B.V., Nagarajan G. Novel Delivery Systems in Cancer Chemotherapy. Research & Reviews in Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 2013; 2 (1): 8-19.

7. Hu Q., Sun W., Wang C., Gu Z. Recent advances of cocktail chemotherapy by combination drug delivery systems. Adv. Drug Deliv. Rev. 2016; 98: 19-34. DOI: 10.1016/j. addr.2015.10.022.

8. Peer D., Karp J.M., Hong S., Farokhzad O.C., Margalit R., Langer R. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nat. Nanotechnol. 2007; 2 (12): 751-760. DOI: 10.1038/nnano.2007.387.