Рисунок 4. Схема прибора для определения размера частиц методом лазерной дифракции
Пробоподготовка
Методика пробоподготовки должна обеспечивать получение репрезентативного образца требуемого объема для измерения размера частиц.
Спреи, аэрозоли и пузырьки газа в жидкости измеряются непосредственно, поскольку пробоподготовка или разведение могут изменить распределение частиц по размеру.
Сыпучие порошки также можно преобразовать в аэрозоли при помощи диспергаторов, использующих энергию сжатого газа или перепады давления. Полученный аэрозоль проходит через зону измерения, после чего попадает во впускное отверстие вакуумного блока, где частицы аэрозоля собираются.
В качестве дисперсионной среды могут быть использованы вода и различные органические растворители (этиловый спирт, метиловый спирт, изопропиловый спирт, гексан, ацетон, толуол и другие), что должно быть отражено в фармакопейной статье.
Определение диапазона концентраций
Для того чтобы получить приемлемое соотношение «сигнал - шум» в детекторе, концентрация частиц в дисперсии должна превышать минимальный уровень. Также она должна быть меньше максимального уровня для избежания многократного рассеяния.
На диапазон концентраций влияют: ширина лазерного луча, расстояние, проходимое лучом лазера в зоне измерения, оптические свойства частиц и чувствительность элементов детектора. Измерения необходимо проводить при различных концентрациях частиц для определения оптимального диапазона концентраций для каждого характерного образца материала.
Принцип метода
Образец, диспергированный в жидкости или газе с необходимой концентрацией, подвергается воздействию лазерного облучения. Свет, рассеянный от частиц на различных углах, измеряется многоэлементным детектором. Численные значения, представляющие профиль рассеяния света, регистрируются для последующего анализа. В дальнейшем эти значения математически преобразуются с помощью оптической модели в доли от общего объема отдельных размерных классов, формируя, таким образом, объемное распределение частиц по размеру.
Метод не может отличить рассеяние от отдельных частиц и рассеяние от кластеров частиц, т.е. агломератов или агрегатов. В случае если образцы содержат агломераты или агрегаты частиц, и если необходимо определить распределение отдельных частиц по размеру, то перед измерением кластеры диспергируют на отдельные частицы. Для несферических частиц получают соответствующее распределение эквивалентных сфер по размеру, поскольку метод предполагает использование сферических частиц в своей оптической модели. Полученное распределение частиц по размеру может отличаться от распределений, основанных на других физических принципах (например, седиментации или ситовом определении).
Методика
Измерение размеров частиц осуществляют на малоугловых измерителях дисперсности (например, на приборе типа МИД-5) в соответствии с руководством по эксплуатации прибора и инструкцией пользователя.
После соответствующей регулировки оптической части прибора проводят фоновое измерение среды, в которой отсутствуют дисперсные частицы. Уровень сигнала фона должен быть ниже соответствующего порогового значения. После фонового измерения проводят измерение пробы. Обычно при измерении проводится большое число регистраций сигнала на элементах детектора и определяется среднее значение для каждого элемента. Положение и размер элементов детектора, фокусное расстояние линзы определяют диапазон углов рассеяния для каждого элемента.
Большинство приборов также измеряют интенсивность центрального луча. Различие интенсивностей центрального луча в дисперсной системе и фонового измерения является параметром затемнения и свидетельствует об интенсивности рассеянного света и концентрации частиц.
Специфические условия проведения анализа по измерению размера частиц и их распределению в конкретных лекарственных средствах указывают в фармакопейных статьях.
Результаты измерений
Результаты обычно представляют в виде интегрального объемного распределения частиц по размеру (рис. 5). Величины xm отражают размер частиц, где m - доля частиц с размером x и менее. Для оценки распределения по размеру обычно используют значения x10, x50 и x90.
x - размер частиц, определяемый как диаметр объема эквивалентной сферы; Q3 (x) - объемная доля частиц с размером x и менее; x10, x50, x90 - размер частиц, соответствующий объемной доле 10, 50 и 90% соответственно
Рисунок 5. Интегральное объемное распределение частиц по размеру
8. Определение размеров эритроцитов
В лабораторных анализах крови преобладают исследования свойств эритроцитов.
Основное исследуемое свойство - деформабильность эритроцитов, определяющая эффективность газообмена и способность движения в микрососудах. При ряде патологических состояний деформационная лабильность эритроцитов существенно ухудшается. В современных технологиях с помощью кровотока осуществляется транспортировка наноструктурированных частиц к различным органам. Этот процесс требует оперативного контроля деформабильности эритроцитов
Не менее важной проблемой биофизики и медицины является исследование действия токсинов на наноструктуру мембран клеток крови. Главными показателями качества крови признаны морфология и структура мембран эритроцитов. В этой связи актуальной задачей представляется анализ дефектов мембран при действии токсинов.
Метод лазерной дифракции также прекрасно зарекомендовал себя в решении этих задач. Как было описано выше, он имеет преимуществ перед другими методами, что позволяет его использовать для глубокого анализа крови достаточно экспрессно и с высокой точностью.
Наиболее ярко и наглядно применение метода лезерной дифракции для анализа крови описано в работе [4].
Принцип метода описан в первой главе реферата, а также в предыдущем разделе, поэтому здесь мы рассмотрим тонкости работы с образцами крови и возможности применения метода на практике.
Суть методики
Вблизи стенки сосуда эритроцит движется в потоке с градиентом скорости, он деформируется и, вращаясь, движется как гусеница танка. Эритроциты хаотически распределены в потоке, но все эритроциты своей узкой стороной движутся вдоль сосуда. Просвечивая слой суспензии эритроцитов излучением лазера можно наблюдать стационарные дифракционные картины в виде эллипсов. Анализ изменения дифракционных картин позволяет судить деформационной лабильности эритроцитов.
Подготовка образца крови.
Работают также с суспензией эритроцитов. Пробы крови стабилизирутся 0,3% раствором цитрата натрия. Далее, пробы крови объемом 0,1 мл помещаются в 10 мл 0,9% растворителя хлорида натрия для приготовления лекарственных форм для инъекций. Уже здесь мы можем отметить просто пробоподготовки материала.
Рисунок 6. Подготовленный для анализа образец крови
Рисунок 7. Экспериментальная установка
Рисунок 8. Схема исследования эритроцитов методом лазерной дифракции
В работе было показано, что применение метода лазерной дифракции отличается простотой и удобством использования для исследования клеток крови. Зафиксированный интервал изменения индекса деформируемости эритроцитов от 0,06 до 0,35 и погрешность измерений (2 - 3%) согласуются с опубликованными результатами в литературе.
9. Оценка диспергирования пищевого комка в зависимости от микрорельефа окклюзионной поверхности зубов
В работе [5] показано, что использование метода лазерной дифракции позволяет достоверно установить влияние микрорельефа окклюзионной поверхности зубов на степень диспергирования твердых частиц в пищевом комке.
На поверхностях каждого зуба располагается огромное количество бугорков, углублений, формирующих его микроархитектонику, что обеспечивает необходимый процесс помола пищи и создания пищевого комка. Недостаточное измельчение твердых частиц пищевого комка в полости рта приводит к дисфункции пищеварительной системы. Использование метода лазерной дифракции позволяет достоверно установить влияние микрорельефа окклюзионной поверхности зубов на степень диспергирования твердых частиц в пищевом комке. Как указывалось в предыдущем разделе, метод достаточно подробно описан выше, и в данном разделе мы остановимся на методической части выполнения работ. Материал для исследования также переводили в суспензию.\
Подготовка суспензии с образцом для проведения измерений
Для приготовления суспензии в кювету, содержащую 15 см3 дистиллированной воды, добавляли исследуемый образец, затем суспензию диспергировали в течение 5 сек. с использованием ультразвукового диспергатора.
Проведение измерений
Для исключения влияния оптических свойств дисперсионной среды на светорассеяние частиц и соответственно на расчет распределения их по размерам сначала проводилось измерение величины интенсивности фона («холостое измерение») на дистиллированной воде. Затем приготовленную суспензию исследуемого образца жевательной пробы объёмом от 0,1 до 5 мл мерной пипеткой переносили в кювету с жидкостью. Концентрация исследуемой жидкой среды была подобрана оптимально, если световая интенсивность находилась в пределах 35 - 75?% от размера измерительной шкалы прибора. Для предотвращения коагуляции частиц в исследуемой жидкой среде использовался миксер, входящий в комплект прибора.
Для объективного анализа формы и размеров конгломератов частиц ореха до и после герметизации восьми моляров проводилось исследование с использованием сканирующего электронного микроскопа (СЭМ).
Результаты показали хорошую сходимость и подтвердили возможность использования метода лазерной дифрации для исследования диспергирования твердых частиц в пищевом комке.
Заключение
Таким образом, в работе показано, что лазерная дифракция - широко применяемая технология анализа размеров частиц в медицине в настоящее время, подходящая для материалов, размер частиц которых составляет от сотен нанометров до нескольких миллиметров.
Главными причинами ее успеха являются:
· Широкий динамический диапазон: начиная от размера меньше микрона и заканчивая несколькими миллиметрами;
· Быстрые измерения: получение результатов;
· Высокая повторяемость - за счёт анализа большого количества частиц в каждом измерении;
· Непрерывный контроль и управление процессом диспергирования частиц;
· Высокая производительность;
· Отсутствие необходимости калибровки;
· Общепризнанная технология, требования к которой определяет стандарт ISO13320 (2009).
Один из недостатков метода лазерной дифракции заключается в том, что он не учитывает форму частиц анализируемых материалов. Все расчеты основываются на предположении, что частицы имеют сферическую форму. Поэтому распределение частиц по размеру, получаемое в результате анализа, на самом деле является распределением эквивалентных сферических частиц. Но в представленных случаях этого вполне достаточно.
1. https://www.mybeckman.ru/resources/technologies/laser-diffraction
2. МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ Определение распределения частиц по размеру методом лазерной дифракции света ОФС.1.2.1.0008.15 (Лазерная дифракция, малоугловое светорассеяние, расчет по теории Ми ГОСТ Р 8.777-2011 ГСИ. Дисперсный состав аэрозолей и взвесей. Определение размеров частиц по дифракции лазерного излучения ISO 13320-1:1999 Particle size analysis - Laser diffraction methods - Part 1: General principles)
3. Франк Г.М., Лемажихин Б.К. Определение размеров эритроцитов методом дифракции света. // Труды института биологической физики. - 1955, вып. 1, с. 276
4. Вохминцев А.П. и др. Деформируемость эритроцитов и способы ее клинической диагностики. // Современные наукоемкие технологии. -2004, №3. С. 54.
5. Михайловский С.Г., Ломиашвили Л.М., Седельников В.В., Дроздов В.А., Тренихин М.В. Использование метода лазерной дифракции для оценки диспергирования пищевого комка в зависимости от микрорельефа окклюзионной поверхности зубов // Проблемы стоматологии 2017, т. 13, №2, стр. 8-14 2017, Екатеринбург, УГМУ