Материал: Определение диацетила в некоторых пищевых продуктах

Алифатические одноатомные спирты - пропиловый, бутиловый, изобутиловый, амиловый, изоамиловый, гексиловый и другие. Они являются продуктами метаболизма дрожжей. На 20 - 40% алифатические одноатомные спирты в винах представлены изоамиловым и изобутиловым спиртами. Содержание алифатических одноатомных спиртов составляет в белых винах 150 - 400 мг/л, в красных - 300 - 600 мг/л. В небольших количествах они формируют аромат вин, а в больших - ухудшают их органолептические свойства. Содержание алифатических двух- и трехатомных спиртов достигает 16 - 18 г./л. На 90% они представлены 2,3 - бутиленгликолем (300 - 1500 мг/л) и глицерином (400-15000 мг/л), которые смягчают вкус вина. Алифатические ненасыщенные спирты (0,5-8,0 мг/л), представленные терпеновыми спиртами (гераниол, линалиол, цитронеллол и другие) и ароматические спирты, представленные в основном фенилэтиловым спиртом, определяют ароматические свойства вин. Все спирты, кроме этанола, в количествах, определяемых в вине, безопасны в токсикологическом отношении и пищевой ценности, за исключением глицерина, не представляют.

Альдегиды жирного ряда в винах на 90% представлены уксусным и на 10% пропионовым альдегидами. Вина, не подвергавшиеся обработке двуокисью серы, содержат от 30 до 50 мг/л ацетальдегида, а обработанные - до 200 мг/л. Содержание ацетальдегида возрастает при хересовании (до 600 мг/л), старении, аэрации вин и действии посторонней микрофлоры. В больших количествах он придает оттенок старого, ровного вина и относится к числу основных факторов, определяющих вкус вин типа марсалы. Из-за высокой реакционной способности альдегиды конденсируются с веществами, содержащими аминогруппу, с образованием меланоидов, восстанавливаются в соответствующие спирты и взаимодействуют с другими продуктами брожения. Содержание альдегидов фуранового ряда (фурфурол, оксиметилфурфурол и метилфурфурол) в винах не превышает 30 мг/л. Кетоны (ацетон, диацетил, 2-бутанон, 2-пентанон и бутиролактон) содержатся в вине в следовых количествах. Лишь ацетоин определяется в концентрациях 3-30 мг/л.

Содержание этиловых эфиров жирных кислот в вине составляет обычно 50 - 200 мг/л, этиловых эфиров - 100 - 500 мг/л. Преобладает этилацетат (20 - 200 мг/л). При длительной выдержке в винах накапливаются в основном кислые эфиры винной, яблочной и янтарной кислот. Максимальное содержание сложных эфиров определяется в хересе (до 1000 мг/л). Большинство эфиров обладает приятным фруктовым запахом. Установлено, что энантовый эфир значительно улучшает, а эфиры уксусной, масляной и валериановой кислот - ухудшают органолептические свойства вина. Ацетали, продукты взаимодействия альдегидов со спиртами, содержатся в винах в количестве 1 - 20 мг/л. Диэтилацеталь - основной представитель обладает приятным фруктовым ароматом. Воски и масла присутствуют в вине в ничтожных количествах. Все эти соединения не влияют на пищевую ценность вина.

Глюкоза и фруктоза - основные моносахариды винограда почти полностью утилизируются дрожжевыми клетками при приготовлении сухих вин [11]. Сахароза обычно превращается в инвертированный сахар. Кроме гексоз, в винах обнаруживают L-арабинозу (500 - 1260 мг/л), следы других пентоз и полисахариды. К последним относятся пектиновые вещества, содержание которых достигает 800 мг/л при суточной потребности 15 - 16 г. Это не позволяет причислить их к категории соединений, определяющих детоксикационные и радиопротекторные свойства вина.

Кислоты вин частично поступают в них из винограда и частично образуются в процессе ферментации как интермедианты метаболизма дрожжей. Из алифатических монокарбоновых кислот в наибольших количествах представлены уксусная (400 - 1500 мг/л), муравьиная (20 - 100 мг/л), пропионовая (10 - 150 мг/л), изомасляная (30 - 100 мг/л), изовалериановая (30 -100 мг/л), капроновая (10 - 100 мг/л), каприловая (10 - 150 мг/л) и каприновая (10 - 150 мг /л) кислоты.

Из алифатических поликарбоновых кислот присутствуют щавелевая (до 150 мг/л) и янтарная (250 - 1500 мг/л). Алифатические монокарбоновые оксикислоты представлены в основном молочной (500 - 5000 мг/л) и глюконовой (до 120 мг/л) кислотами. Среди алифатических поликарбоновых оксикислот центральное место принадлежит винной (1500 - 5000 мг/л) и яблочной (10 - 5000 мг/л). Другие (метиляблочная, слизевая, сахарная и лимонная) содержатся в незначительных или следовых количествах. Альдегидо- и кетокислоты (глиоксилевая, глюкуроновая, галактуроновая, пировиноградная и альфа-кетоглутаровая) присутствуют в вине в количестве, не превышающем 1000 мг /л.

Ароматические кислоты бензойного и коричного рядов (оксибензойная, протокатехиновая, ванилиновая, галловая, сиреневая, салициловая и другие) типичны прежде всего для красных вин (50 - 100 мг/л). В белых винах их существенно меньше (1-5 мг/л). Большинство этих кислот имеют фенольный радикал и соответственно могут быть отнесены к классу фенолокислот. Активная кислотность вин обычно колеблется в пределах 3,0 - 4,2, а титруемая - 5 - 7 г/л в пересчете на самую сильную кислоту - винную. Органические кислоты находятся, в основном, в связанном или полусвязанном состоянии. Они определяют бактерицидные, вкусовые и ароматические свойства вина. Конкретные данные о пищевой ценности кислот вин отсутствуют. Однако учитывая высокую биологическую активность некоторых из них, можно предположить, что органические кислоты способны вносить определенный вклад в пищевые свойства вин.

Вина содержат мало азотистых соединений от 70 до 780 мг/л, 55% всего азота приходится на полипептиды, от 25 до 40% на свободные аминокислоты и только 3% на белки, поступающие из виноградной кожуры. Азотсодержащие вещества являются необходимой питательной средой дрожжей и субстратом для синтеза альдегидов. Они и продукты их взаимодействия оказывают влияние на цвет, аромат, вкус и стабильность вин.

Дикетоны и оксикетоны в вине

Многие исследователи занимались: биосинтезом 2,3 - бутандиона (диацетила) и З-окси-2-бутандиона (ацетоина) при спиртовом и молочнокислом брожении [14].

Ацетоин образуется во второй фазе спиртового брожения в результате конденсации двух молекул уксусного альдегида

Образование ацетоина во второй фазе спиртового брожения

Эта реакция получила название ацетоиновой конденсации двух уксусных альдегидов.

Другие авторы считают, что ацетоин продуцируют микроорганизмы путем конденсации двух молекул пировиноградной кислоты

Наиболее подробно был рассмотрен биосинтез ацетоина и диацетила дрожжей и молочнокислых бактерий. В настоящее время считают, что ацетоин и диацетил. образуются из ацетомолочной кислоты. На рисунке представленна схема ферментативного синтеза ацетоина и диацетила.

Схема ферментативного синтеза ацетоина и диацетила

Как видно из схемы, исходными продуктами для синтеза ацетоина и диацетила являются пировиноградная кислота и тиамин-пирофосфат (*ТРР), при конденсации которых образуется б-ацетомолочная кислота. Последняя является предшественником ацетоина и диацетила.

Для биосинтеза ацетомолочной кислоты необходимы две молекулы пировиноградной кислоты, из одной образуется оксиэтилтиа-минпирофосфат, а также ионы Мn или Mg. Ферментативный механизм образования ацетомолочной кислоты следующий: вначале действием пируватдекарбоксилазы пировиноградная кислота превращается в оксиэтилтиаминпирофосфат, который под действием фермента а-ацетолактатсинтетазы образует с другой молекулой пировиноградной кислоты ацетомолочную кислоту. Последняя, под действием фермента ацетолактатдекарбоксилазы декарбоксилируется в ацетоин.

Ацетомолочная кислота участвует в биосинтезе аминокислот, в частности валина, который оказывает ингибирующее действие на образование ацетомолочной кислоты и диацетила. В данном случае валин, видимо, является аллостерическим регулятором синтеза ацетомолочной кислоты и действует как ингибитор по принципу обратной связи на а-ацетолактатсинтетазу.

Имеется ряд работ, указывающих и на другой путь биосинтеза диацетила, и ацетоина дрожжами, не связанный с образованием ацетомолочной кислоты, по схеме (рисунок)

Биосинтез диацетила и ацетоина

Из схемы видно, что в начале синтеза из пировиноградной кислоты образуется оксиэтилтиаминпирофосфат, который с новой молекулой уксусного альдегида образует комплекс энзимацетоинтиа-минпирофосфат, превращающийся затем в ацетоин. Последний, дегидрируясь, дает диацетил. Отличительной чертой в этом синтезе является то, что не сама пировиноградная кислота реагирует с оксиэтилтиаминпирофосфатом, а последний с новой молекулой уксусного альдегида образует ацетоин. Эта реакция аналогична реакции ацетоиновой конденсации двух молекул уксусных альдегидов. В этой реакции процесс декарбоксилирования также связан с образованием комплекса фермент-уксусный альдегид, который затем переносится на свободный уксусный альдегид, образуя в результате ацетоин.

Существует и другой путь биосинтеза диацетила, заключающийся в том, что дрожжи в присутствии НАД+ превращают одну молекулу пировиноградной кислоты в ацетил-КоА. Затем ацетил-КоА конденсируется с другой молекулой пировиноградной кислоты, образуя ацетомолочную кислоту, с последующим декарбоксилированием ее в ацетоин по схеме (рисунок)

Схема синтеза диацетила

Рассматривая схемы биосинтеза ацетоина и диацетила можно считать, что наиболее правдоподобной является схема конденсации оксиэтилтиаминпирофосфата со свободным уксусным альдегидом с образованием энзимацетоин-ТРР-комплекса и распадом этого комплекса в ацетоин. Эта схема имеет место при алкогольном брожении, когда образуется значительное количество уксусного альдегида при декарбоксилировании пировиноградной кислоты.

Если ацетоин и диацетил образовывались бы из ацетомолочной кислоты, то валин должен был бы ингибировать их образование, так как эти соединения появляются на пути его синтеза. Как показали исследования, валин почти не ингибирует образования диацетила и ацетоина при алкогольном брожении (рисунок)

Синтез диацетила и ацетоина при алкогольном брожении

Существовало мнение, что дйацетилредуктаза содержится только в бактериях. Но в последние годы было показано, что диацетйлредуктаза содержится и в винных дрожжах. Этот фермент участвует в восстановлении диацетила в ацетоин при дображивании виноматериалов и получении неокисленных вин. Ацетоин в присутствии - бутиленгликольдегидрогеназы и НАД-Н2 восстанавливается в 2-3-бутиленгликоль по схеме (рисунок)

Синтез 2-3-бутиленгликоля

Эти соединения образуют в биологических средах, в частности в винах, окислительно-восстановительную систему (рисунок)

Биосинтез диацетила из 2-3-бутиленгликоля

В зависимости от активности действующих в этой системе ферментов превалируют те или иные продукты его превращения. Если в вине превалируют восстановительные процессы, то накапливается 2,3 - бутиленгликоль. Наоборот, в аэробных условиях окислительные процессы усиливаются и в вине увеличивается количество уксусного альдегида, диацетила и этилацетата, что приводит к ухудшению качества вина. При отгоне дикетонов, в частности диацетила, происходит распад б-ацетооксикислоты и увеличивается содержание диацетила и пентандиона.

В наибольшем количестве в грузинских винах содержится 2,3 - бутандиол, затем З-окси-2-бутандион (ацетоин) и 2,3 - пентадиол, наименьшее количество - 2,3 - бутандиона (диацетила) и 2,3 - пентандиона. В процессе алкогольного брожения ацетоин в результате протекания восстановительных процессов восстанавливается в 2-3-бутандиол, поэтому он и накапливается в больших количествах (до 680 мг/л). Содержание ацетоина в винах колеблется от 8,03 до 36,18 мг/л, а диацетила - от 0,17 до 2,92 мг/л.

,3 - Бутандион, З-окси-2-бутандион и 2,3 - бутандиол - соединения с четырьмя углеродными атомами в цепи, они, как показано, составляют окислительно-восстановительную систему в винах. Аналогичные три соединения, но с пятью углеродными атомами, были найдены в винах. Содержание 2,3 - пентадиола колеблется от 0,6 до 18 мг/л, З-окси-2-пентанона от 0,45 до 2,80 и 2,3 - пентандиона от 0,02 до 0,28 мг/л. Винные дрожжи в процессе алкогольного брожения способны восстанавливать 2,3 - пентандион и образовывать значительное количество 2,3 - пентандиола.

Чем меньше количество 2,3 - бутандиона (диацетила) и 2,3 - пентандиона в винах, тем выше их дегустационная оценка. Красные марочные вина обычно содержат больше 2,3 - бутандиона и 2,3 - пентандиона, чем белые, и дегустационная оценка их заметно ниже. Видимо, красящие вещества связывают эти карбонильные соединения.

Известно, что в винах, подвергшихся яблочно-молочному брожению, количество 2,3 - бутандиона значительно увеличивается и достигает 2,8-4,3 мг/л. При проветривании вин количество его также увеличивается. Этому способствует содержание в винах ионов железа и меди, которые катализируют окисление З-окси-2-бутанона в 2,3 - бутадион.

1.5 Тона окисленности в вине

Тон окисленности может появиться в сухих лёгких винах [12].Такие вина невыразительны на вкус и имеют несвежий запах, они быстро темнеют на воздухе. Иногда к окисленному белому вину применяют термин «мадеризированное» или «портвейнизированное».

Известно, что букет вина изменяется при обработке и выдержке [13]. Так, качество шампанских виноматериалов заметно ухудшается при проведении частых переливок и особенно в случае доступа воздуха. Еще Бертло, встряхивая выдержанные вина в сосуде с воздухом, обнаруживал, что вкус их становился «выветренным». В отличие от Бертло Пастер утверждал, что кислород необходим для созревания вина. Однако научного объяснении этим явлениям не было дано.

Полагают, что тона окисленности в винах связаны с продуктами окислительных превращений аминокислот, а также с наличием в вине свободного ацетальдегида. Хотя некоторые исследователи считают, что, во-первых, количество аминокислот не играет решающей роли в возникновении явлений переокисленности и, во-вторых, не только свободный уксусный альдегид обусловливает появление тона окисленности в вине.

Одним из факторов, влияющих на тон окислинности вина, является диацетил. Установили, что переокисленность вина вызывается диацетилом, который образуется при окислении ацетоина и при концентрации свыше 0,8 мг/л ухудшает качество вина.

Проводили изучение изменения букетистых веществ при аэрации и окислении шампанских виноматериалов и белых столовых вин. Для этого проводили аэрирование выдержанного столового вина рислинг Эльзасский в течение 4 часов. Затем насыщенное кислородом вино в одном случае оставляли в открытом сосуде на 3 суток, и в другом опыте выдерживали 6 суток при температуре + 5° С в закрытом сосуде, заполненном вином на 50%. Выбранное для опытов вино имело очень приятный, ярко выраженный букет, характерный для лучших вин рислинга Эльзаса. В букете чувствовались тона выдержанного вина и совершенно отсутствовала окисленность. В процессе 4-часового аэрирования букет вина резко ухудшился, стал менее сильным, появилась разлаженность. Через 3 суток выдержки в аэробных условиях вино стало простым, в букете исчезли тона выдержки, сильно обнаруживалась выветренность.

Большие количества диацетила в белых (выше 0,8-0,9 мг/л) и красных винах (больше 1,8 мг/л) придают вину окисленный тон, при концентрации выше 2 мг/л окисленный тон переходит в мышиный привкус.