Автореферат: Новая технология культивирования высших базидиомицетов в искусственно замкнутой экосистеме

На правах рукописи

03.01.06 - биотехнология

(в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

НОВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВЫСШИХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ В ИСКУССТВЕННО ЗАМКНУТОЙ ЭКОСИСТЕМЕ

Калашников Андрей Анатольевич

Саратов - 2011

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова»

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Миронов Александр Давыдович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, старший научный сотрудник, Дыкман Лев Абрамович

доктор биологических наук, профессор, Бушов Александр Владимирович

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет»

Защита состоится «17» февраля 2011 г. в 1200 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.

Автореферат диссертации разослан «13» января 2011 г. и размещен на сайте университета www.sgau.ru.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова», ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор Карпунина Л.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Современное развитие грибоводства в России выявило потребность создания новых интенсивных технологий, удовлетворяющих современным требованиям: сокращение сроков обрастания субстрата и выгонки плодовых тел, устойчивость к конкурентной микрофлоре, высокая продуктивность и товарные качества мицелия и плодовых тел.

Несмотря на возрастающие объемы культивирования вешенки, промышленное производство в значительной степени сдерживается из-за отсутствия продуктивных отечественных сортов и штаммов (Таксономический анализ..., 2002). На сегодняшний день в государственном реестре селекционных достижений РФ зарегистрированы четыре сорта, относящиеся к вешенке устричной, и один сорт вешенки флоридской. Общеизвестно, что непрерывное культивирование какого-либо сорта гриба в течение длительного времени неизбежно приводит к потере урожайности в результате генетического «старения». Поэтому, получение новых гибридов вешенки, обладающих повышенной урожайностью по сравнению с родительскими производственными штаммами, является наиболее актуальной задачей в области селекции грибов.

Не менее важной задачей является защита субстрата для получения плодовых тел от контаминации посторонней микрофлорой при помощи экологически чистых биопрепаратов, не способных оказывать негативное влияние на окружающую среду и здоровье потребителя. Современные способы выращивания мицелия и плодовых тел высших грибов-базидиомицетов основаны на интенсивной стерильной технологии в искусственно замкнутой экосистеме - специальных контейнерах с использованием растительных субстратов, следуя которой возможно получение быстрого и обильного урожая. Однако, применение этой технологии связано со значительными материальными и энергетическими затратами, включающими наличие специализированных бактериологических лабораторий и помещений для подготовки субстрата и выращивания мицелия и плодовых тел грибов небольшими грибоводческими фирмами.

В связи с этим, важной задачей современной грибной индустрии является создание новых технологий, позволяющих при незначительном повышении материальных затрат получить высокий урожай плодовых тел грибов. Выявлению различных факторов, влияющих на продуктивность плодовых тел, посвящен ряд работ (Eger, Wang, Anderson, 1972; Eger, 1974; Larraya, 2002).

Цель работы: разработка новой технологии культивирования мицелия и плодовых тел Pleurotus ostreatus, позволяющей с минимальными затратами в относительно простых условиях получать качественный мицелий и высокий урожай плодовых тел гриба.

Задачи исследования:

Получить новые гибриды P. ostreatus путем скрещивания производственного и полученного из природных объектов штаммов вешенки.

Оценить влияние различных стимуляторов на интенсивность роста мицелия изучаемых штаммов гриба на плотных и жидких питательных средах.

Провести сравнительный анализ урожайности вешенки на растительных субстратах, обработанных перекисью водорода.

Изучить влияние бактерий Bacillus subtilis 26D - основного действующего вещества промышленного биофунгицида «Фитоспорин-М» на характер взаимодействия P. ostreatus и естественного контаминанта - плесневого гриба р. Trichoderma.

Оценить урожайность изучаемых штаммов на субстрате, обработанном препаратом «Фитосприн-М». стимулятор рост гриб вешенка

Провести промышленные испытания разработанной технологии культивирования P. ostreatus.

Научная новизна. Получен новый гибридный штамм Pleurotus ostreatus Т5, при скрещивании P. оstreatus ВС (промышленный штамм) P. оstreatus L (дикий штамм). Обоснована эффективность применения естественного стимулятора - экстракта дубовой коры для интенсификации роста мицелия при мелкотоварном и промышленном культивировании грибов рода P. ostreatus - Вешенка.

Впервые изучено биотическое влияние промышленного биофунгицида «Фитоспорин-М», содержащего в качестве биологически активного агента клетки Bacillus subtilis 26Д, на жизнедеятельность P. ostreatus в частично замкнутой экосистеме.

Практическая значимость работы. Разработанная технология культивирования плодовых тел Pleurotus ostreatus в перспективе может быть использована грибоводческими хозяйствами России, как в мелкотоварных, так и промышленных объемах. Данная технология используется для выращивания грибов вешенки в ОАО «Совхоз-Весна» (г. Саратов), что подтверждается актом о внедрении от 21.04.2009. Материалы диссертационной работы вошли в учебное пособие «Проблемы и перспективы биологического разнообразия» (в соавторстве с Мироновым А.Д., Бондаренко Г.В., Соболевой Л.В., Зиминым П.В., Калашниковым А.А., 2008) для студентов, специализирующихся в области биоэкологии, рекомендованное и одобренное Учебно-методическим советом биотехнологического факультета СГАУ им. Н.И. Вавилова. Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций и написании дипломных работ в СГАУ им. Н.И. Вавилова.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Получено 125 потенциально гибридных дикарионов, из которых было отобрано 5 изолятов, отличающихся от других по способности образовывать наибольшее количество примордиев при 22-25єС

2. Экстракт дубовой коры стимулирует рост мицелия, что зафиксировано при выращивании клеток мицелия гибрида P. ostreatus Т5 на шуттель-апарате и лабораторном ферментере «Анкум-2M.

3. Штамм Bacillus subtilis 26Д, выделенный из препарата «Фитоспорин-М», с мицелиальной культурой P. ostreatus Т5 и спорами чистой культуры Trichoderma spp. на среде МС ингибировал развитие микромицета Trichoderma spp.

4. Наиболее оптимальным субстратом для получения плодовых тел гибрида является солома; обработка материала перекисью водорода служит не только дополнительным средством для поддержания необходимой стерильности, но и повышает общую урожайность.

5. При культивировании штамма P. ostreatus Т5 на субстрате, обработанном препаратом «Фитоспорин-М», происходит уменьшение времени появления примордий и общее увеличение урожайности в первую и вторую волны плодоношения.

Работа выполнена на кафедре экологии, биологии, физиологии и фармакологии ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» в рамках научно-исследовательской темы: «Изучение биологических свойств высших грибов-базидиомицетов».

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на:

- Всероссийской конференции «Актуальные проблемы ветеринарной патологии, физиологии, биотехнологии, селекции животных. Современные технологии переработки сельскохозяйственной продукции», (Саратов, 2008);

- Всероссийской научно-практическая конференция. «Актуальные проблемы ветеринарной патологии сельскохозяйственных животных и птиц», (Саратов, 2008);

- Международной научно-практической конференции, посвященной 95-летию госагроуниверситета. «Вавиловские чтения-2008», (Саратов, 2008).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 4 работы, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей в себя материалы и методы исследования, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов, предложений производству, списка используемых литературных источников, включающего 116 источников, в том числе 68 зарубежных авторов и приложений. Работа изложена на 144 страницах и иллюстрирована 22 рисунками, 20 таблицами.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объекты, материалы и методы исследований

В работе использованы два штамма Pleurotus ostreatus БС и P. оstreatus L, полученные из коллекции грибов Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук. Исследование проводили по следующей схеме (рис. 1).

Вегетативный мицелий данных штаммов культивировали на модифицированной среде Семерджиевой с добавлением экстракта дубовой коры.

Гибридизацию исходных штаммов проводили по методу Г. Фритше (1969), используя для этих целей моноспоровую селекцию.

Глубинное культивирование мицелия проводили в ферментере "Анкум-2М" в 6 л вышеуказанной жидкой среды, а также на шуттель-аппарате оригинальной конструкции.

Субстрат для посевного мицелия готовили из зерна пшеницы по традиционной методике (Бисько, 1983; 1987; Бухало, 1988; Методы приготовления…, 1982).

Для изучения оптимального состава субстрата для получения плодовых тел готовили следующие материалы: древесные опилки хвойных и лиственных пород деревьев, пшеничная солома.

Производственные испытания проводили на базе грибоводческого хозяйства комплекса ОАО «Совхоз-Весна», расположенного в г. Саратов. В качестве контрольного штамма в производственных экспериментах использовали штамм P. ostreatus HK-35 Duna, полученным из коллекции данного хозяйства.

Для создания дополнительной степени стерильности, при необходимости (рекомендуется для мелкотоварного производства), в субстрат при запаривании добавляли 6% перекись водорода (150 мл/л).

Фунгицидное воздействие препарата "Фитоспорин-М" изучали в процессе подготовки субстрата, культивирования и образования плодовых тел. Раствор препарата (1,5:1000) добавляли непосредственно в воду после запаривания субстрата и достижения температуры воды от 38-42єС. Через 12 часов выдержки субстрата в воде с биофунгицидом, затем воду сливали, а субстрат использовали непосредственно для экспериментов.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы «STATISTICA 6.0» MS Office.

Рис. 1. Схема проведения эксперимента

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Подбор совместимых монокарионов и отбор фертильных дикарионов вешенки обыкновенной

В результате проведенных экспериментов по скрещиванию исходных штаммов было получено 125 потенциально гибридных дикарионов, из которых было отобрано 5 изолятов, отличающихся от других по способности образовывать наибольшее количество примордий при 22-25єС, обозначенные, соответственно, Т1- Т5 (табл. 1).

Таблица 1 - Динамика образования примордиев

Предварительные эксперименты показали, что наиболее активным ростом мицелия на плотных питательных средах, а также более ранними сроками появления примордий обладает штамм Т5, что и позволило отобрать его для дальнейших исследований.

Полученный штамм способен так же, как и родительские, образовывать кластеры (сростки плодовых тел) от 2-4 до 20-30 шт. Шляпка 1-8 см в диаметре, в молодом возрасте выпуклая, светло-коричневая, затем - плоская, тарелкоподобная, более темная. Пластинки сероватые, ножка, как правило, центральная или слегка эксцентрическая, 4-6х0,5-1,6 см, серовато-белая. Мякоть плотная, сероватая (рис. 2).