Министерство образования и науки Российской Федерации
ГОУ ВПО «Волгоградский государственный технический университет»
Химико-технологический факультет
Кафедра «Промышленная экология и безопасность жизнедеятельности»
СЕМЕСТРОВАЯ РАБОТА
по дисциплине «Основы микробиологии и биотехнологии»
на тему:
«Микроклональное размножение растений»
Выполнил:
студент группы РХТ-449
Асанов Р.М.
Проверил:
проф. кафедры ПЭБЖ
Владимцева И.В.
Волгоград 2015
Содержание
Введение
1. Цель работы
2. Процесс микроклонального размножения
3. Укоренение побегов
4. Микроклональное размножение и оздоровление растений
Заключение
Список используемых источников
Введение
Биотехнология - наука о методах и технологиях создания и использования генетических трансформированных биологических объектов. Один из методов биотехнологии - это микроклональное размножение (клеточная биотехнология), основанное на способности клеток и тканей к регенерации, что обеспечивает ускоренное получение ценных форм и линий сельскохозяйственных растений. Оно не зависит от сезона, позволяет получать оздоровленный посадочный материал от вирусной и бактериальной инфекции, дает возможность выращивать сотни тысяч растений из одной меристемы, размножать ценные генотипы, получать биологические препараты пищевого, кормового и медицинского направления.
1. Цель работы
Изучить метод микроклонального размножения растений и его значение по литературным источникам; сделать выводы о проделанном исследовании.
2. Процесс микроклонального размножения.
Процесс микроклонального размножения можно разделить на 4 этапа:
1. Выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры.
2. Собственно размножение, когда достигается получение максимального количества меристематических клонов.
3. Укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (+2оС, +10оС).
4. Выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.
Для культивирования тканей на каждом из четырех этапов требуется применение определенного состава питательной среды.
На первом этапе необходимо добиться получения хорошо растущей стерильной культуры. В тех случаях, когда трудно получить исходную стерильную культуру экспланта, рекомендуется вводить в состав питательной среды антибиотики (тетрациклин, бензилпенициллин и др.) в концентрации 100--200 мг/л. Это в первую очередь относится к древесным растениям, у которых наблюдается тенденция к накоплению внутренней инфекции.
На первом этапе, как правило, используют среду, содержащую минеральные соли по рецепту Мурасига и Скуга, а также различные биологически активные вещества и стимуляторы роста (ауксины, цитокинины) в различных сочетаниях в зависимости от объекта. В тех случаях, когда наблюдается ингибирование роста первичного экспланта, за счет выделения им в питательную среду токсичных веществ (фенолов, терпенов и других вторичных соединений), снять его можно, используя антиоксиданты. Это возможно двумя способами: либо омывкой экспланта слабым его раствором в течение 4--24 ч, либо непосредственным добавлением в питательную среду. В качестве антиоксидантов используют: аскорбиновую кислоту (1 мг/л), глютатион (4--5 мг/л), дитиотриэтол (1--3 мг/л), диэтилдитиокарбомат (2--5 мг/л), поливинилпирролидон (5000--10000 мг/л). В некоторых случаях целесообразно добавлять в питательную среду адсорбент - древесный активированный уголь в концентрации 0,5--1%. Продолжительность первого этапа может колебаться от 1 до 2 месяцев, в результате которого наблюдается рост меристематических тканей и формирование первичных побегов.
2 этап -- собственно размножение. На этом этапе необходимо добиться получения максимального количества мериклонов, учитывая при этом, что с увеличением субкультивирований увеличивается число растений-регенерантов с ненормальной морфологией и возможно наблюдать образование растений-мутантов.
Как и на первом этапе, используют питательную среду по рецепту Мурасига и Скуга, содержащую различные биологически активные вещества, а также регуляторы роста. Основную роль при подборе оптимальных условий культивирования эксплантов играют соотношение и концентрация внесенных в питательную среду цитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее часто используют БАП в концентрациях от 1 до 10 мг/л, а из ауксинов--ИУК и НУК в концентрациях до 0,5 мг/л.
При долгом культивировании растительных тканей на питательных средах с повышенным содержанием цитокининов (5--10 мг/л) происходит постепенное накопление их в тканях выше необходимого физиологического уровня, что приводит к появлению токсического действия и формированию растений с измененной морфологией. Вместе с тем, возможно наблюдать такие нежелательные для микроклонального размножения эффекты, как подавление пролиферации пазушных меристем, образование витрифицированных (оводненных) побегов и уменьшение способности растений к укоренению. Отрицательное действие цитокининов возможно преодолеть, по данным Н.В. Катаевой и Р.Г. Бутенко, путем использования питательных сред с минимальной концентрацией цитокининов, обеспечивающих стабильный коэффициент размножения, или путем чередования циклов культивирования на средах с низким и высоким уровнем фитогормонов.
3 и 4 этапы -- укоренение побегов, их последующая адаптация к почвенным условиям и высадка в поле являются наиболее трудоемкими этапами, от которых зависит успех клонального микроразмножения. На третьем этапе, как правило, меняют основной состав среды: уменьшают в два, а иногда и в четыре раза концентрацию минеральных солей по рецепту Мурасига и Скуга или заменяют ее средой Уайта, уменьшают количество сахара до 0,5--1% и полностью исключают цитокинины, оставляя один лишь ауксин. В качестве стимулятора корнеобразования используют в-индолил-3-масляную кислоту (ИМК), ИУК или НУК.
3. Укоренение побегов
Укоренение побегов проводят двумя способами:
1) выдерживание побегов в течение нескольких часов (2--24 ч) в стерильном концентрированном растворе ауксина (20--50 мг/л) и последующее их культивирование на агаризованной среде без гормонов или непосредственно в подходящем почвенном субстрате (импульсная обработка);
2) непосредственное культивирование побегов в течение 3--4 недель на питательной среде, содержащей ауксин в невысоких концентрациях (1--5 мг/л в зависимости от исследуемого объекта). В последнее время предложен метод укоренения пробирочных растений в условиях гидропоники. Этот метод позволяет значительно упростить этап укоренения и одновременно получать растения, адаптированные к естественным условиям. Для картофеля возможно использовать безсубстратную гидропонику для получения мини-клубней. Затенение нижней части культуральных сосудов плотной черной материей или добавление в питательную среду активированного угля способствует укоренению побегов.
Пересадка растений-регенерантов в субстрат является ответственным этапом, завершающим процесс микроклонального размножения. Наиболее благоприятное время для пересадки пробирочных растений -- весна или начало лета.
Растения с двумя-тремя листьями и хорошо развитой корневой системой осторожно вынимают из колб или пробирок пинцетом с длинными концами или специальным крючком. Корни отмывают от остатков агара и высаживают в почвенный субстрат, предварительно простерилизованный при 85--90° С в течение 1--2 ч. Для большинства растений в качестве субстратов используют торф, песок (3:1); торф, дерновую почву, перлит (1:1:1); торф, песок, перлит (1:1:1). Исключение составляют семейство орхидных, для которых готовят субстрат, состоящий из сфагнового мха, смеси торфа, листьев бука или дуба, сосновой коры (1:1:1).
Приготовленным заранее почвенным субстратом заполняют пикировочные ящики или торфяные горшочки, в которых выращивают растения-регенеранты. Горшочки с растениями помещают в теплицы с регулируемым температурным режимом (20--22° С), освещенностью не более 5 тыс. лк и влажностью 65--90%. Для лучшего роста растений создают условия искусственного тумана. В тех случаях, когда нет возможности создать такие условия, горшочки с растениями накрывают стеклянными банками или полиэтиленовыми пакетами, которые постепенно открывают до полной адаптации растений.
Через 20--30 дней после посадки хорошо укоренившиеся растения подкармливают растворами минеральных солей Кнудсона, Мурасига и Скуга, Чеснокова, Кнопа (в зависимости от вида растений) или комплексным минеральным удобрением. По мере роста растений их рассаживают в большие емкости со свежим субстратом. Дальнейшее выращивание акклиматизированных растений соответствует принятой агротехнике выращивания для каждого индивидуального вида растений.
Процесс адаптации пробирочных растений к почвенным условиям является наиболее дорогостоящей и трудоемкой операцией. Нередко после пересадки растений в почву наблюдается остановка в росте, опадение листьев и гибель растений. Эти явления связаны, в первую очередь, с тем, что у пробирочных растений нарушена деятельность устьичного аппарата, вследствие чего происходит потеря большого количества воды. Во-вторых, у некоторых растений в условиях in vitro не происходит образования корневых волосков, что приводит, в свою очередь, к нарушению поглощения воды и минеральных солей из почвы. Поэтому целесообразно на третьем или четвертом этапах микроклонального размножения применять искусственную микоризацию растений (для микотрофных), учитывая их положительную роль в снабжении растений минеральными и органическими питательными веществами, водой, биологически активными веществами, а также в защите растений от патогенов.
Индийскими учеными предложен простой метод предотвращения быстрого обезвоживания листьев растений, выращенных in vitro, во время их пересадки в полевые условия. Метод заключается в том, что листья в течение всего акклиматизационного периода следует опрыскивать 50%-ным водным раствором глицерина или смесью парафина, или жира в диэтиловом эфире (1:1). Применение этого метода помогает избежать длинных и затруднительных процессов закаливания пробирочных растений и обеспечивает 100%-ную их приживаемость.
4. Микроклональное размножение и оздоровление растений
микроклональный размножение растение
Существует много методов микроклонального размножения, а также различных их классификаций. Согласно одной из них, предложенной Мурасиге в 1977 году, процесс можно осуществлять следующими путями:
1. Активация пазушных меристем.
2. Образование адвентивных побегов тканями экспланта.
3. Возникновение адвентивных побегов в каллусе.
4. Индукция соматического эмбриогенеза в клетках экспланта.
5. Соматический эмбриогенез в каллусной ткани.
6. Формирование придаточных эмбриоидов в ткани первичных соматических зародышей (деление первичных эмбриоидов).
Н.В. Катаева и Р.Г. Бутенко (1983) выделяют два принципиально различных типа микроклонального размножения:
1. Активация уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля).
2. Индукция возникновения почек или эмбриоидов de novo :
а) образование адвентивных побегов непосредственно тканями экспланта;
б) индукция соматического эмбриогенеза;
в) дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани.
Основной метод, использующийся при микроклональном размножении растений - активация развития уже существующих в растении меристем. Он основан на снятии апикального доминирования.
Этого можно достичь двумя путями: а) удалением верхушечной меристемы стебля и последующим микрочеренкованием побега in vitro на безгормональной среде; б) добавлением в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов. Как правило, в качестве цитокининов используют 6-бензиламинопурин (БАП) или 6-фурфуриламинопурин (кинетин) и зеатин.
Полученные таким образом побеги отделяют от первичного экспланта и вновь самостоятельно культивируют на свежеприготовленной питательной среде, стимулирующей пролиферацию пазушных меристем и возникновение побегов более высоких порядков.
Часто в качестве экспланта используют верхушечные или пазушные почки, которые изолируют из побега и помещают на питательную среду с цитокининами. Образующиеся пучки побегов делят, при необходимости черенкуют и переносят на свежую питательную среду. После нескольких пассажей, добавляя в питательную среду ауксины, побеги укореняют in vitro, а затем переносят в почву, где создают условия, способствующие адаптации растений.
В настоящее время этот метод широко используется в производстве посадочного материала сельскохозяйственных культур, как технических, так и овощных, а также для размножения культур промышленного цветоводства (например: гвоздики), тропических и субтропических растений, плодовых и ягодных культур, древесных растений. Для некоторых культур, таких как картофель, технология клонального размножения поставлена на промышленную основу. Применение метода активации развития существующих меристем позволяет получать из одной меристемы картофеля более 100000 растений в год, причем технология предусматривает получение в пробирках микроклубней - ценного безвирусного семенного материала.
Второй метод - индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта. Он основан на способности изолированных частей растения при благоприятных условиях питательной среды восстанавливать недостающие органы и таким образом регенерировать целые растения. Можно добиться образования адвентивных почек почти из любых органов и тканей растения (изолированного зародыша, листа, стебля, семядолей, чешуек и донца луковиц, сегментов корней и зачатков соцветий). Этот процесс происходит на питательных средах, содержащих цитокинины в соотношении с ауксинами 10:1 или 100:1. В качестве ауксина используют ИУК или НУК. Таким способом были размножены многие представители семейства лилейных, томаты, древесные растения (из зрелых и незрелых зародышей).