Материал: микра от 104 группы

34.Брожение. Получение энергии анаэробными микроорганизмами. Химизм процесса.

Брожение (субстратное фосфорилирование) - разновидность анаэробного дыхания, при котором и донором и акцептором водорода является органическое вещество. При анаэробном дыхании микроорганизмы получают энергию не путем окисления, а путем распада сложных органических веществ до более простых. Микроорганизмы, у которых имеет место анаэробное дыхание, называют анаэробами.

При брожении происходит расщепление сложных органических веществ до более просто устроенных с выделением небольшого количества энергии. При поступлении глюкозы в клетку, происходит гликолиз и образуется ПВК. Дальнейшие ее превращения зависят от набора ферментов анаэробных бактерий. В зависимости от того какие конечные продукты образуются, выделяют разные типы брожения:

· Молочнокислое брожение вызывается лактобактериями, бифидобактериями, стрептококками, образуя из ПВК молочную кислоту (гомоферментативное брожение) или молочную, янтарную, уксусную кислоты, ацетон (гетероферментативное брожение). Эти бактерии применяются в производстве молочно-кислых продуктов: ряженки, простокваши, кефира, йогуртов и творога.

· Маслянокислое брожение. Возбудителями этого вида брожения являются анаэробные бактерии рода клостридии, а также бактероиды, фузобактерии и другие микроорганизмы, вызывающие у человека опасные анаэробные инфекции. Основным продуктом брожения является масляная,изомасляная, уксусная, валериановая кислоты.

· Пропионовокислое брожение также вызывается анаэробами - пропионибактериями (обитатели кожи и слизистой оболочкичеловека и животных могут вызывать анаэробные инфекции), которые используются в производстве сыров. Конечный продукт брожения - пропионовая кислота.

· Спиртовое брожение. Вызывают дрожжи. В результате спиртового брожения образуется этиловый спирт, что издавна используется в пивоварении и виноделии.

· Бутиленгликолевое брожение. В результате брожения образуются бутиловый спирт, этиленгликоль, срероводород и другие токсические продукты. Этот вид брожения вызывают кишечная палочка и другие энтеробактерии, в том числе - возбудители кишечных инфекций - сальмонеллёза, дизентерии.

При субстратном фосфорилировании из глюкозы или других источников углерода выделяется незначительное количество энергии, так как образующиеся при этом продукты брожения (молочная кислота, спирты и др.) сохраняют в себе значительные количества энергии. Поэтому в анаэробных условиях бактериальная культура для получения необходимой энергии во много раз больше разлагает пищевого материала, чем в присутствии кислорода. Теплообразование при развитии бактериальной флоры в органическом материале (навоз, торф, мусор) может привести к его самовозгоранию.

Изучение ферментов бактерий имеет большое практическое значение для разработки методов диагностики (идентификации) возбудителей инфекционных заболеваний по набору ферментов, а также для создания современных биотехнологий получения продуктов питания в том числе молочнокислых продуктов, сыра, хлеба, вина, пива и т.д.

Химизм процесса брожения был расшифрован в 1933 г. в результате независимых исследований немецкого ученого Г. Г. Эмбдена, немецко-американского — О.Ф. Мейергофа и польско-советского — Я.О. Парнаса.

Было установлено, что брожение представляет собой последовательную цепочку реакций, протекающих в цитоплазме клетки бродящего организма под воздействием вырабатываемых здесь ферментов. В процессе анаэробной диссимиляции глюкозы различают три стадии: подготовительную, энергетическую и завершающую.

«Пусковой» реакцией катаболического распада глюкозы является ее фосфорилирование за счет АТФ с образованием глюкозо-6-фос- фата и АДФ, в результате чего молекула глюкозы активируется для участия в последующих превращениях. Катализирует реакцию фермент гексокиназа (КФ 2.7.1.1).

Затем образовавшийся глюкозо-6-фосфат (альдоза) превращается во фруктозо-6-фосфат (кетозу). Эта реакция происходит под воздействием фермента глюкозо-6-фосфат—изомеразы (КФ 5.3.1.9).

Третья реакция — фосфорилирование фруктозо-6-фосфата за счет АТФ с образованием фруктозо-1,6-бисфосфата и АДФ. Она катализируется ферментом фосфофрукгокиназой (КФ 2.7.1.11) и представляет собой еще одну «пусковую» реакцию брожения.

35. Аммонификация мочевины. Возбудители и ход процесса. Условия, определяющие накопление аммиака в почве и навозе.

Аммонификация- процесс, сопровождающийся выделением аммиака при разложении белков и азотосодержащих соединений

К азотосодержащим органическим соединения, часто встречающимися в природе, относятся мочевина, мочевая и гиппуровая кислота.

Разложение мочевины

• Мочевина – конечный продукт превращения соединений азота в организме человека и животных.

• Мочевину могут синтезировать почвенные грибы.

• Это же соединение образуется при гидролитическом распаде аргинина под действием фермента аргиназы

• Многие бактерии и грибы синтезируют уреазу, могут использовать мочевину как источник азота и для синтеза белков

• Бактерии, разлагающие мочевину – уробактерии

• Бактерии развиваются при щелочной среде рН 9-10, что позволяет вызвать распад значительного количества мочевины до аммиака.

• Представители:

Micrococcus urea,

Bacillus pasteurii,

Sporosarcina urea

• Источник углерода – углеводы и соли органических кислот

Ход процесса

Под действием микроорганизмов, содержащих фермент уреазу, мочевина в несколько этапов превращается в аммиак и диоксид углерода:

 Образующиеся на первом этапе углеаммиачная соль мало устойчиво и быстро разлагается:

Значение

• Мочевина содержит 46% азота используется как удобрение

• Физиологический смысл распада мочевины по-видимому сводится к переводу аминный формы азота в более легко своему аммиачную 

Гиппуровая кислота

• Мочевая и гиппуровая кислота также играют важную роль в белковом обмене млекопитающих, пресмыкающихся, насекомых и птиц 

• в экскрементах змей до 90 % мочевой кислоты, в помете птиц -25%

• В моче млекопитающих содержание мочевой кислоты незначительное

• Разложение мочевой кислоты в местах скопления помета птиц гуано в условиях засушливого климата приводит к накоплению нитратов. Поэтому в Южной Африке, Чили, Перу есть богатые залежи нитратов

Ход процесса

Мочевая и гиппуровая кислоты быстро распадаются под влиянием гидролитических ферментов ряда микроорганизмов:

Условия, определяющие накопление аммиака в почве и навозе.

• Количество азота зависит от типа почвы. В пахотном слое разных почв количество азота колеблется в широких пределах; в дерново-подзолистых, песчаных и супесчаных почвах – 0,04 – 0,08%, суглинистых и глинистых – 0,1– 0,15%. Серые лесные и черноземные почвы наиболее богаты общим азотом (0,3 – 0,5% и более). В каштановых почвах его количество колеблется от 0,1 (в светло-каштановых и бурых) до 0,2—0,25% (в темно-каштановых).

• неисчерпаемым источником азота является атмосфера (среди прочих газов атмосферы на молекулярный азот приходится 78%. Однако молекулярный азот, будучи инертным газом, не может непосредственно усваиваться растениями.

Четвертая реакция процесса брожения — расщепление фруктозо- 1,6-бисфосфата и образование двух молекул фосфотриоз: фосфоди- гидроксиацетона (ФДА) и 3-фосфоглицеринового альдегида (3-ФГА). Фермент альдолаза (КФ 4.1.2.13) катализирует разрыв углеродной цепочки фруктозо-1,6-бисфосфата посередине, чему способствует

«Пусковой» реакцией катаболического распада глюкозы является ее фосфорилирование за счет АТФ с образованием глюкозо-6-фос- фата и АДФ, в результате чего молекула глюкозы активируется для участия в последующих превращениях. Катализирует реакцию фермент гексокиназа (КФ 2.7.1.1).

Затем образовавшийся глюкозо-6-фосфат (альдоза) превращается во фруктозо-6-фосфат (кетозу). Эта реакция происходит под воздействием фермента глюкозо-6-фосфат—изомеразы (КФ 5.3.1.9).

Третья реакция — фосфорилирование фруктозо-6-фосфата за счет АТФ с образованием фруктозо-1,6-бисфосфата и АДФ. Она катализируется ферментом фосфофрукгокиназой (КФ 2.7.1.11) и представляет собой еще одну «пусковую» реакцию брожения.

Четвертая реакция процесса брожения — расщепление фруктозо- 1,6-бисфосфата и образование двух молекул фосфотриоз: фосфоди- гидроксиацетона (ФДА) и 3-фосфоглицеринового альдегида (3-ФГА). Фермент альдолаза (КФ 4.1.2.13) катализирует разрыв углеродной цепочки фруктозо-1,6-бисфосфата посередине, чему способствует

Энергетическая стадия брожения также включает пять реакций, в ходе которых энергия, содержащаяся в глюкозе, постепенно высвобождается и запасается в форме АТФ (рис. 61).

Она начинается с того, что 3-фосфоглицериновый альдегид под воздействием фермента триозофосфатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.12) при участии фосфорной кислоты превращается в 1,3-бисфосфогли- цериновую кислоту (1,3-бисФГК). Энергия, высвобождающаяся в результате окисления альдегидной группы 3-фосфоглицеринового альдегида, аккумулируется в образуемой высокоэнергетической связи, с помощью которой присоединяется фосфатная группа.

Затем фермент фосфоглицераткиназа (КФ 2.7.2.3) катализирует перенос остатка фосфорной кислоты, содержащего высокоэнергетическую связь, от карбоксильной группы 1,3-бисфосфоглицерино- вой кислоты на АДФ с образованием АТФ и 3-фосфоглицериновой кислоты (3-ФГК).

В результате этой реакции энергия, ранее высвободившаяся при окислении альдегидной группы 3-фосфоглицеринового альдегида до карбоксильной, оказывается запасенной в виде АТФ.

После этого 3-фосфоглицериновая кислота под воздействием фермента фосфоглицерат-фосфомутазы (КФ 5.4.2.1) превращается в 2-фосфоглицериновую кислоту (2-ФГК).

Образовавшаяся 2-фосфоглицериновая кислота под воздействием фермента енолазы (КФ 4.2.1.11) превращается в 2-фосфоенолпиро- виноградную кислоту (2-ФЕП). При этом молекула 2-фосфоглице- риновой кислоты отдает молекулу воды. Это вызывает перераспределение энергии внутри молекулы субстрата, и связь, с помощью которой к нему присоединен остаток фосфорной кислоты, становится высокоэнергетической.

На последнем этапе энергетической стадии брожения 2-фосфо- енолпировиноградная кислота с помощью фермента пируваткиназы (КФ 2.7.1.40) передает содержащий высокоэнергетическую связь остаток фосфорной кислоты молекуле АДФ, в результате чего образуются АТФ и енолпировиноградная кислота (енолПВК). Последняя весьма нестойка и быстро неферментативным путем превращается в устойчивую кетоформу — пировиноградную кислоту (ПВК).

Таким образом, в ходе брожения молекула глюкозы расщепляется ферментативным путем в десяти последовательных реакциях до двух молекул пировиноградной кислоты и двух пар атомов водорода.

Образовавшаяся в результате реакций гликолиза пировиноград- ная кислота может подвергаться дальнейшим превращениям, направление которых зависит от условий среды (аэробных или анаэробных) и от специфических особенностей данного организма. В аэробных условиях она может окисляться до диоксида углерода и воды в процессе дыхания, а при анаэробной диссимиляции последующие превращения пировиноградной кислоты составляют завершающий этап брожения.

• фиксация молекулярного азота и пополнение запасов его в почве осуществляется двумя путями: под влиянием грозовых разрядов и с помощью определенных микроорганизмов. Под действие электрических и фотохимических реакций при грозах образуются аммиак и окислы азота, которые поступают в почву с атмосферными осадками. По данным А.В.Петербургского, в осадках всегда больше аммонийного, чем нитратного азота, и общий приход его достигает в среднем около 4кг/га*год.

• Гораздо большее значение в обогащении почв азотом имеет биологическая фиксация атмосферного азота свободноживущими микроорганизмами, сине-зелеными водорослями и клубеньковыми бактериями. Потенциальные возможности симбиотических и несимбиотических свободноживущих азотфиксаторов неравноценны. Свободноживущие азотфиксирующие микроорганизмы способны при благоприятных условиях ассимилировать 10-15 кг/га*год связанного азота. Клубеньковые бактерии поглощают значительно больше азота из атмосферы. По данным Д.Н.Прянишникова , ежегодно на 1 га люцерна накапливает 300(до 500-600), клевер 150-160 (до 250-300), люпин до 150, соя до 100, вика, горох- 50-60 кг азота. Количество фиксированного азота зависит от вида бобового растения Ph почвенного раствора, величины урожая. Наиболее активно азотфиксация осуществляется в фазу цветения бобовых культур.

• Некоторое количество аммонийных удобрений, а также аммония, накапливающегося при минерализации органических соединений, закрепляется почвенными минералами

• Потери азота из удобрений существенно уменьшаются при использовании гранулированных и медленно растворяющихся удобрений. К ним относятся уреаформ (конденсат мочевины с формальдегидом), гранулированная мочевина с оболочкой из элементарной серы, уреа-зет (конденсат мочевины с ацетальдегидом), изобутилен-диуреа и т. д.

• Минеральные азотные удобрения позволяют быстро повышать урожаи, действуя практически в год внесения в почву. Под зерновые культуры в среднем вносят около 30 кг/га минеральных азотных удобрений в год

• большое внимание уделять культурам бобовых растений, которые не только обогащают почву азотом, но и дают корм, богатый белком.

• Содержание органического вещества в навозе составляет 20—25%; количество питательных для растений веществ ограничивается долями процента (0,5% азота, 0,2% Р2О5 , 0,6% К2О) и около 75% воды. Органическая часть навоза в расчете на беззольную сухую массу содержит до 40% перегнойных соединений, около 30% целлюлозы и лигниноподобных веществ.

• Навоз, хранившийся плотным способом, содержит значительное количество аммиачного asoia, эффективность его гораздо выше, чем при других способах хранения

• Потери азота при разложении навоза во время хранения значительно сокращаются при добавлении к нему (при укладке в штабеля) фосфоритной муки в количестве 3% массы навоза.

• До 40% азота находится в навозе в виде гиппуровой и мочевой кислот, но большая часть — в виде мочевины. Последняя легко гидролизуется уробактериями и многими сапротрофными бактериями. При этом образуется углекислый аммоний, который легко диссоциирует на NH3 и СО2 .

• При повышенной температуре распад мочевины и карбоната аммония усиливается, поэтому при горячем способе приготовления навоза потеря азота возрастает до 30%. Правильное приготовление навоза холодным способом резко снижает потери азота. Если вместо соломенной подстилки применяют торфяную, хорошо поглощающую аммиак, то потери снижаются до нескольких процентов

• В бесподстилочном навозе значительная часть азота (40—60%) содержится в форме аммиака. Поэтому при его использовании целесообразно применять ингибиторы нитрификации.

• В навозе много бактерий рода Pseudomonas, представителей группы кишечной палочки и других аммонификаторов, гнилостные спорообразующие бактерии — Bacillus subtilis, В. mesentericus, В. megateriит, В. mycoides и т. д., но при холодном способе приготовления эти виды размножаются слабо.