2.1 Колориметрические методы
Разработан ряд колориметрических методов определения пиридоксина и его производных, основанных на способности их образовывать окрашенные комплексы с различными соединениями. Они используются для определения витамина В6 в растворах, а также для идентификации различных форм его после разделения методами хроматографии и электрофореза на бумаге. К методам этой группы относятся, например, реакции на фенольный гидроксил.
В присутствии хлорного железа и реактива фолина витамин В6 образует окрашенные продукты. Колориметрические методы с использованием диазотированных растворов сульфаниловой кислоты, n-нитроанилина, 2,6-дихлорхинонхлоримида или n-аминоацетофенона зависят от присутствия в молекуле витамина В6 фенольного гидроксила в n-положении. Из методов этой группы наиболее широко, особенно в сочетании с хроматографией и электрофорезом, используются реакции с дихлорхинон-хлоримидом, преимущественно с пиридоксином, при которой появляется синее окрашивание (проба Гиббса).
Разработаны колориметрические методы, связанные с наличием формильной группы в положении 4 у пиридоксаля и пиридоксальфосфата. В этом случае для получения окрашенных комплексов используют ряд реактивов: м-оксипропадрин, этаноламин, тиофен, фенилгидразин.
Wada и Snell (1961) разработали количественный метод раздельного определения пиридоксаля и пирлдоксальфосфата в биологическом материале, определяя их в виде фенилгидразонов. Образование циангидрина при взаимодействии цианистого калия с формильной группой пиридоксальфосфата используют в одном из спектро-фотометрических методов его определения[10].
2.2 Спектрофотометрические методы
Известно, что все формы и производные витамина В6 имеют характерные спектры поглощения, претерпевающие сдвиги при изменениях рН и других воздействиях. По характеру спектра при различных значениях рН пиридоксальфосфат значительно отличается от других форм витамина В6. При рН 7,0 все формы витамина В6 имеют два максимума поглощения. Для каждой формы витамина B6 определены коэффициенты молярной экстинкции, позволяющие при различных значениях рН рассчитать их количественное содержание. При исследовании спектров пиридоксалевых ферментов обнаружено наличие у большинства из них максимума поглощения в области 410--430 нм, характерного для пиридоксальфосфата, связанного с NН2-группой апофермента. Изучение изменений спектров поглощения высокоочищенных препаратов различных пиридоксалевых ферментов в присутствии субстратов и ингибиторов нашло широкое применение при выяснении механизмов их действия, а также характера связи кофермента с апоферментами.
2.3 Флуорометрические методы
Флуорометрические методы определения витамина В6 основаны на измерении флюоресценции раствора непосредственно при освещении его лучами с определенной длиной волны либо после предварительного превращения витамина В6 в производное, обладающее более высокой степенью флюоресценции (например, 4-пиридоксиловая кислота и ее лактон; циангидрин пиридоксаля). Флуорометрические методы отличаются высокой чувствительностью, превышающей в 10--100 раз чувствительность колориметрических и спектрофотометрических определений. Использование спектрофлуориметров позволит точно измерять избирательное поглощение и определять максимальную интенсивность флюоресценции, что позволяет определять витамин В6 в концентрации 0,002 мкг/мл и выше. При нагревании пиридоксиловой кислоты в кислой среде происходит превращение ее в соответствующий лактон, обладающий сильной голубой флюоресценцией, по интенсивности значительно (примерно в 25 раз) превосходящей флюоресценцию кислоты[11].
2.4 Ферментативные методы
Определение коферментных форм витамина В6 ферментативными методами основано на реакции взаимодействия фосфорилированных форм витамина - пиридоксальфосфата и пиридоксаминофосфата, присутствующих в исследуемом материале, с апоферментами некоторых пиридоксалевых ферментов. В определенных интервалах скорости ферментативных реакций пропорциональны концентрации исследуемых коферментов. Впервые для определения пиридоксальфосфата в биологическом материале использован апофермент тирозиндекарбоксилазы Str. faecalis, выращенного на синтетической среде, лишенной витамина В6. Позже для этой цели был предложен апофермент триптофаназы из Е. coli, полученный в условиях, обеспечивающих максимальную диссоциацию кофермента. Наиболее чувствительным методом является определение фосфорилированных форм витамина В6. с помощью апофермента аспартаттрансаминазы, полученного из дрожжей. Этот метод позволяет определять до 0,00001 мкг/мл суммы пиридоксальфосфата и пиридоксаминфосфата.
2.5 Микробиологические методы
При изучении биологической роли витамина В6, в частности как ростового фактора для микроорганизмов, установлено, что в нем нуждаются главным образом молочнокислые бактерии и дрожжи. Различные формы витамина В6 одними и теми же микроорганизмами используются по-разному. Это дало возможность разработать методы дифференциального микробиологического определения различных форм витамина В6, используя молочнокислые бактерии и дрожжи. Поскольку микроорганизмы в противоположность животным для роста могут использовать только свободные, не связанные с белками формы витамина В6, перед применением микробиологических методов исследуемый образец необходимо подвергать автоклавированию в кислой среде. Дрожжи Saccharomyces carlsbergensis способны использовать для роста в одинаковой степени пиридоксин, пиридоксаль и пиридоксамин, поэтому дрожжевой метод нашел применение для количественного определения суммарного содержания витамина В6 в исследуемом материале.
2.6 Методы хроматографии и электрофореза
Известен ряд методов разделения производных витамина В6 на колонках с ионообменным смолами, а также путем хроматографии на бумаге с последующим определением в виде окрашенных комплексов или по интенсивности флюоресценции. Для определения различных форм витамина В6 предложен метод электрофореза на бумаге, разработанный для чистых растворов. Ряд авторов применили этот метод для качественного определения производных витамина В6 в моче. Попытка использовать его для количественного и дифференцированного определения витамина В6 в моче и крови встречает ряд трудностей[12].
2.7 Методы, рекомендуемые ГФ
Для количественного определения витамина В6 в препарате ГФ рекомендует два метода:
1. Метод кислотно-основного титрования в неводных средах.
2. Метод нейтрализации по связанной хлороводородной кислоте.
Метод кислотно-основного титрования в неводных средах
Около 0,15 г препарата (точная навеска) растворяют в 20 мл безводной уксусной кислоты при слабом нагревании. Раствор охлаждают, прибавляют 5 мл раствора ацетата окисной ртути и титруют 0,1 н. раствором хлорной кислоты до появления изумрудно-зеленого окрашивания (индикатор - кристаллический фиолетовый).
Параллельно проводят контрольный опыт.
1 мл 0,1 н. раствора хлорной кислоты соответствует 0,02056 г С8H11NO3 * HCl, которого в пересчете на сухое вещество должно быть не менее 99,0%[13].
Метод нейтрализации по связанной хлороводородной кислоте
Около 0,1 г препарата (точная навеска) растворяют в воде в мерной колбе емкостью 50 мл и доводят объем раствора водой до метки. К 20 мл полученного раствора прибавляют 2-3 капли раствора бромтимолового синего и титруют из микробюретки 0,1 н. раствором едкого натра до первого появления голубой окраски.
1 мл 0,1 н. раствора едкого натра соответствует 0,003545 г Cl, которого в пересчете на сухое вещество должно быть не менее 17,1% и не более 17,35%/[14].
Заключение
Оба метода количественного определения витамина В6, предложенные в Государственной Фармакопее, являются спектрофотометрическими. В результате изучения литературных источников по данной теме можно утверждать, что спектрофотометрия является самым перспективным методом анализа, который позволяет на относительно несложном оборудовании быстро и точно проводить количественный анализ веществ.
Этот метод используют на всех этапах фармацевтического анализа лекарственных препаратов (испытание подлинности, доброкачественности, количественное определение).
Список литературы
1. Витамин B6 (пиридоксин) [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://hnb.com.ua/articles/s-zdorovie-vitamin_b6_piridoksin-317. - Загл. с экрана. (20.04.2014)
2. Авакумов В.М. Современное учение о витаминах / В.М. Авакумов. М. : Знание, 1971. С.214.
3. Алексенцев В.Г. Витамины и человек. М.: Дрофа, 2006. С.156.
4. Пиридоксин, полное описание [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://sportswiki.ru/%D0%92%D0%B8%D1%82%D0%B0%D0%BC%D0%B8%D0%BD_%D0%926- Загл. с экрана. (20.04.2014)
5. Спиричев В.Б. Химическая энциклопедия: В 5 т.: т.1 / М.1988. С.386.
6. Биохимические свойства витамина B6 (пиридоксина) [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://polyvita.ru/bioximicheskie-svojstva-vitamina-b6-piridoksina. html. - Загл. с экрана. (20.04.2014)
7. Мамонтов С. Г. Биология для поступающих в вузы / Мамонтов С.Г. / М.: Дрофа, 1994. С.480.
8. Витамин B6 [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.vitamini.ru/vitamin_18.html- Загл. с экрана. (20.04.2014)
9. Теоретические и клинические аспекты науки о питании, т. 8 - Методы оценки обеспеченности населения витаминами, под ред. М.Н. Волгарева, М., 1987. С.91.
10. Витамины и методы их определения. Горький, ГГУ,1981. С.212.
11. Мелентьева Г. А. Фармхимия. М.: Медицина, 1976. С.475.
12. Мелентьева Г. А. Фармхимия. М.: Медицина, 1976. С.489.
13. Государственная фармакопея, 10 издание. М: Медицина, 1968. С.573.
14. Государственная фармакопея, 11 издание. М: Медицина, 1987. С.48.