Статья: Методика количественного определения пигментов в листьях моринги

Пензенский государственный аграрный университет

Пензенский государственный университет

Методика количественного определения пигментов в листьях моринги

Е.А. Кутихина

Е.Е. Курдюков

И.Я. Моисеева

Л.Н. Бибякова

Н.В. Финаенова

г. Пенза

Аннотация

Актуальность и цели. Перспективным лекарственным сырьем моринги масличной являются листья. Листья содержат комплекс биологически активных соединений: белки, минералы, каротиноиды, витамины (тиамин, рибофлавин, аскорбиновая кислота), гликозиды, флавоноиды (рутин, кверцитин) [1, 2]. Основными комплексами природных пигментов в листьях моринги являются производные хлорофилла и каротиноиды, представленные хлорофиллом а и р-каротином [3, 4]. Каротиноиды обладают антиоксидантной, радиопротекторной и антиканцерогенной активностью [5-8]. Хлорофиллы оказывают противовоспалительное, ранозаживляющее и антибактериальное действие, также обладают антиоксидантным эффектом [5, 9]. В настоящее время актуальным является изучение биологически активных соединений (БАС), в частности пигментов, обладающих антибактериальными и противовоспалительными свойствами. В настоящее время на сырье моринги не разработаны методики количественного определения каротиноидов и хлорофилла, в данной работе предоставлен вариант методики количественного определения. Результаты исследования могут быть использованы для разработки нормативной документации на перспективное лекарственное растительное сырье. Цель исследования - разработка методики количественного определения содержания каротиноидов и хлорофилла в листьях моринги. Материалы и методы. Объектами исследования служили высушенные листья моринги. Качественный анализ пигментов проводили методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) из ацетоновой фракции, используя систему растворителей: петролейный эфир - ацетон (6:4) [5, 9]. Для количественного определения каротиноидов и хлорофиллов в извлечениях из сырья моринги использовали спектрофотометрический метод [10-13]. Количественное определение каротиноидов и хлорофиллов в сырье моринги проводили с использованием спирта этилового 95%, гексана, ацетона и смеси ацетона-гексана (1:2). Измерение оптической плотности проводили в максимумах поглощения каротиноидов (450 нм), хлорофилла а (664 нм). Результаты. С помощью ТСХ визуально определяются три пятна, одно из которых желтого цвета с Я/= 0,91 относится к р-каротину, пятна сине-зеленого и желтозеленого цвета с Я/ = 0,9 и 0,08 относятся к хлорофиллам а и Ь соответственно. Выводы. Представлена концепция методики определения каротиноидов и хлорофилла. Было установлено, что лучшим экстрагентом для извлечения каротиноидов (66,31 мг%) является смесь ацетона-гексана (1:2); хлорофилла (0,23%) - смесь ацетона-гексана (1:2).

Ключевые слова: Moringa оМ/ега, р-каротин, хлорофилл а, спектрофотометрия, тонкослойная хроматография

Abstract

Quantitative determination of pigments in moringa leaves

E.A. Kutihina, E.E. Kurdjukov, I.Ja. Moiseeva, L.N. Bibjakova, N.V. Finajonova

Penza State Agrarian University, Penza, Russia ^2,3,4,5Penza State University, Penza, Russia

Background. Moringa oleifera leaves are promising medicinal raw materials. Leaves contain a complex of biologically active compounds: proteins, minerals, carotenoids, vitamins (thiamine, riboflavin, ascorbic acid), glycosides, flavonoids (rutin, querci - tin) [1, 2]. The main complexes of natural pigments in moringa leaves are chlorophyll derivatives and carotenoids represented by chlorophyll a and p-carotene [3, 4]. Carotenoids have antioxidant, radioprotective and anti-carcinogenic activity [5-8]. Chlorophylls have anti-inflammatory, wound-healing and antibacterial effects, and also have an antioxidant effect [5, 9]. Currently, it is important to study biologically active compounds (BAC), in particular pigments that have antibacterial and anti-inflammatory properties. Currently, methods for the quantitative determination of carotenoids and chlorophyll have not been developed on the moringa's raw materials, and a variant of the quantitative determination method is provided in this paper. The results of the study can be used to develop regulatory documentation for promising medicinal plant raw materials. The purpose of the study is to develop methods for quantitative determination of carotenoids and chlorophyll content in Moringa leaves. Materials and methods. The objects of research were dried Moringa leaves harvested in the Penza region. Qualitative analysis of pigments was performed by TLC from the acetone fraction using a system of solvents: petroleum ether-acetone (6:4) [5, 9]. For the quantitative determination of carotenoids and chlorophylls in extracts from raw materials of Moringa used spectrophotometric method [10-13]. Quantitative determination of carotenoids and chlorophylls in Moringa raw materials was performed using 95% ethyl alcohol, hexane, acetone, and a mixture of acetone-hexane (1:2). Optical density was measured at the maximum absorption of carotenoids (450 nm) and chlorophyll a (664 nm). Results. 3 spots are visually determined, one of which is yellow with Rf = 0,91 refers to P-carotene, and blue-green and yellow-green spots with Rf = 0,9 and 0,08 refer to chlorophylls a and b, respectively. Conclusions. The concept of a method for determining carotenoids and chlorophyll is presented. It was found that the best extractant for carotenoid extraction (66,31 mg%) is a mixture of acetone-hexane (1:2), chlorophyll (0,23%) a mixture of acetone-hexane (1:2).

Keywords: Moringa oleifera, p-carotene, chlorophyll a, spectrophotometry, thin-layer chromatography

Введение

Моринга масличная (Moringa oleifera Lam.) семейства моринговых (Moringaceae) является небольшим, быстро растущим листопадным деревом, высотой до 10-12 м [1, 2].

Листья моринги являются перспективным лекарственным растительным источником получения биологически активных соединений для получения фармацевтических субстанций, обладающих широким спектром фармакологической активности, включая противовоспалительный, антибактериальный, антиоксидантный эффект. В листьях моринги содержится комплекс различных полифенольных соединений, за счет которого листья моринги проявляют перечисленные фармакологические эффекты [3, 4].

Материалы и методы

Объектами исследования служили высушенные листья моринги. Качественный анализ суммы каротиноидов и хлорофилла в листьях моринги проводили методом тонкослойной хроматографии из ацетоновой фракции в системе растворителей: петролейный эфир-ацетон (6:4), спирт метиловый-бензол - этилацетат (5:70:25) [5, 6, 9].

Количественное определение суммы каротиноидов и хлорофилла проводили методом прямой спектрофотометрии [10-13]. Масса сырья - 3 г (точная навеска), для извлечения использовали колбу вместимостью 50 мл, прибавляли 25 мл экстрагента, в течение 90 мин перемешивали. Полученный экстракт фильтровали через бумажный фильтр. Отбирали 1 мл извлечения и помещали в мерную колбу на 25 мл, доводили экстрагентом до метки. Определяли оптическую плотность на спектрофотометре СФ-104 при длине волны 450 и 664 нм.

Содержание суммы каротиноидов и хлорофилла в сырье моринги (Х) в пересчете на Р-каротин и хлорофилл а (мг%) вычисляли по стандартной формуле [5].

Статистическую обработку результатов экспериментального исследования проводили с помощью пакета статистических программ: русифицированная версия программы Statistica 6.0 (StatSoft - Russia, 1999), BIOSTAT (S.A. Glantz, McGrawHill, 1998), Microsoft Office (Microsoft Office Pro Plus 2019, договор №028-20-223 от 25.05.2020 - бессрочный). Все измерения проведены в пятикратных аналитических повторностях, в таблицах приведены средние значения. Определялись основные статистические характеристики: среднее значение, ошибка среднего. Достоверность различий рассчитана с помощью Т-критерия Стьюдента. Критическая величина уровня значимости принята равной 0,05. Во всех данных, приведенных в статье, количественные показатели выражены в виде M ± т.

Основная часть

На хроматографических пластинках обнаружили зоны адсорбции от желтого до ярко-оранжевого цвета. Полученные значения коэффициента замедления (Rf) сравнивали со стандартными значениями, описанными в литературе [5, 9, 14]. В системе петролейный эфир-ацетон (6:4) обнаружили зону оранжевого цвета с Rf = 0,91, которая соответствует Р-каротину, две зоны адсорбции зеленого и желто-зеленого цвета с Rf = 0,9 и Rf = 0,08, соответствующие хлорофиллу а и хлорофиллу b.

Исходя из литературных данных, каротиноиды хорошо растворимы в 95% этаноле, ацетоне, гексане, хлороформе [9-13].

Электронные спектры извлечения в диапазоне длин волн 400-500 нм имеют максимум оптической плотности при 450 ± 2 нм (рис. 1), характерные для Р-каротина. В результате сравнения максимума поглощения на полученных УФ-спектрах из извлечения сырья моринги с литературными данными выяснилось, что полученное извлечение преимущественно содержит Р-каротин [9-13].

Рис. 1. УФ-спектр ацетоно-гексанового (1:2) извлечения из листьев моринги: а - максимум поглощения каротиноидов (Р-каротин) при 450 нм; б - максимум поглощения хлорофиллов (хлорофилл а) при 664 нм

В результате проведенного анализа установили, что лучшим экстрагентом для выделения каротиноидов из высушенных листьев моринги является ацетон-гексан (1:2), так как извлекается больше каротиноидов, по сравнению с другими экстрагентами (табл. 1).

Таблица 1. Влияние экстрагента на выход каротиноидов в листьях моринги

Примечание. * Различия достоверны при р < 0,05

Содержание каротиноидов в листьях моринги в пересчете на Р-каротин составило 66,31 мг%. Результаты статистической обработки данных свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения не превышает значения 1,31%.

Количественное определения хлорофилла в листьях моринги проводили методом УФ-спектрофотометрии [5, 9]. Важной особенностью спектра поглощения хлорофилла а служит наличие ярко выраженного максимума при 664 нм (рис. 2).

В результате проведенного анализа установили, что лучшим экстрагентом для выделения хлорофилла из высушенных листьев моринги является ацетон-гексан (1:2), так как извлекается больше хлорофиллов, по сравнению с другими экстрагентами (табл. 2).

моринга масличная лекарственный антиоксидантный

Рис. 2. УФ-спектр ацетоно-гексанового (1:2) извлечения из листьев моринги: а - максимум поглощения хлорофиллов (хлорофилл а) при 664 нм

Таблица 2. Влияние экстрагента на выход хлорофилла в листьях моринги

Примечание. * Различия достоверны при р < 0,05

Содержание суммы хлорофилла в листьях моринги составило 0,23% в пересчете на хлорофилл а и высушенное сырье. Результаты статистической обработки данных свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения не превышает значения 4,55%.

Заключение

1. Определены максимумы поглощения извлечения, при X = 450 ± 2 нм, X = 664 ± 2 нм для каротиноидов и хлорофилла соответственно.

2. Определено, что среднее значение содержания каротиноидов в сырье моринги составляет 66,31 мг%, содержания хлорофилла составляет 0,23%.

Список литературы

1. Foidl N., Makkar H.P.S., Becker K. The potential of Moringa oleifera for agricultural and industrial uses // The Miracle Tree: The Multiple Attributes of Moringa / ed. L.J. Fug - lie. Dakar, Senegal: Church World Service, 2001. P. 45-76.

2. Ndhlala A.R., Mulaudzi R., Ncube B. [et al.]. Antioxidant, antimicrobial and phytochemical variations in thirteen Moringa oleifera Lam. cultivars // Molecules. 2014. Vol. 19, №7. P. 10 480-10 494. URL: http://dx.doi.org/10.3390/molecules190710480

3. Amaglo N.K., Bennet R.N., Curto B.L. Profiling selected phytochemicals and nutrients in different tissues of the multipurpose tree Moringa oleifera L., grown in Ghana // J. of Food Chem. 2010. Vol. 122, №4. P. 1047-1054.

4. Bennett R.N., Mellon F.A., Foidl N. [et al.]. Profiling glucosinolates and phenolics in vegetative and reproductive tissues of the multi-purpose trees Moringa oleifera L. (Horseradish Tree) and Moringa stenopetala L. // J. Agri Food Chem. 2003. Vol. 51. P. 3546-3553.

5. Санникова Е.Г., Компанцева Е.В., Попова О.И., Айрапетова А.Ю. Определение пигментов в сырье ивы трехтычинковой (Salixtriandra L.) методами тонкослойной хроматографии и спектрофотометрии // Химия растительного сырья. 2019. №2. С. 119-127. doi:10.14258/jcprm.2019024077

6. Фоминых М.М., Хомутов Т.О., Курдюков Е.Е. Новая методика количественного определения пигментов в листьях стевии // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Естественные науки. 2020. №2. С. 23-31. doi:10.21685/2307 - 9150-2020-2-3

7. Печинский С.В., Курегян А.Г. Структура и биологические функции каротиноидов // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2013. №9. С. 4-15.

8. Чечета О.В., Сафонова Е.Ф., Сливкин А.И. Стабильность каротиноидов в растительных маслах при хранении // Фармация. 2008. №2. С. 12-14.

9. Первушкин С.В., Куркин В.А., Воронин А.В. [и др.]. Методики идентификации различных пигментов и количественного спектрофотометрического определения суммарного содержания каротиноидов и белка в фитомассе S. platensis (Nords.) Geilt. // Растительные ресурсы. 2002. №1. С. 112-119.

10. Гергель А.В. Спектрофотометрическое определение количественного содержания хлорофиллов и каротиноидов в некоторых растениях представителей рода Moreceae при использовании разных экстрагентов // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции. 2010. №64. С. 25-27.

11. Ульяновский Н.В., Косяков Д.С., Боголицын К.Г. Разработка экспрессных методов аналитической экстракции каротиноидов из растительного сырья // Химия растительного сырья. 2012. №4. С. 147-152.

12. Писарев Д.И., Новиков О.О., Романова Т.А. Разработка экспресс-метода определения каротиноидов в сырье растительного происхождения // Научные ведомости Белгородского государственного университета. 2010. №22. С. 119-122.