Практически все исследователи, изучающие феномен редукции геномов, объясняют его тем, что штаммы с уменьшенными геномами утратили значительную часть генетической информации «за ненадобностью» т.е. в связи с тем, что с переходом к паразитическому существованию в значительной части функций отпала необходимость. Соответственно, признаки, кодируемые этими генами, не стали поддерживаться естественным отбором и гены, их кодирующие, были утрачены [8, 54, 12, 10, 11, 70, 33, 65, 69, 97, 68]. Эта общепринятая концепция представляется мне не совсем корректной.
I.3. Факты, которые трудно объяснить с помощью общепринятой концепции.
Простая концепция утраты генов за ненадобностью не объясняет реальной картины происходящего и, соответственно, оставляет ряд вопросов открытыми.
1. Близкие родственники микроорганизмов, претерпевших редукцию генома, свои геномы не уменьшали, хотя являлись и являются патогенными паразитами (B. henselae, M. tuberculosis, B. pseudomallei, B. bronchiseptica). Геномы некоторых из этих бактерий даже приобретали генетический материал за счёт горизонтального переноса [88, 59, 44, 37].
Существует попытка объяснить различные направления эволюции геномов (потеря против приобретения генов) у близкородственных патогенных бактерий тем, что утрачивающие генетический материал бактерии являются «специалистами», т.е. существуют в одном организме (например, человека), тогда как их родственники, не претерпевающие редукцию геномов, являются «генералистами», т.е. способны инфицировать различных хозяев [9]. В качестве «специалистов» приводятся B. quintana, Rickettsia prowazekii и B. pertussis, а «генералистов» -- их ближайшие родственники B. henselae, Rickettsia conorii и B. bronchiseptica, соответственно. Подразумевается, что геномы «генералистов» не теряют генетический материал, который поддерживается естественным отбором, т.к. нужен для осуществления возможности инфицировать более широкий круг хозяев.
Но, во-первых, возбудитель R. prowazekii, обозначенный как «специалист», был обнаружен в родственниках белки -- летягах [24], а во-вторых, геномы «генералистов» тоже теряют гены. Это показано и для B. bronchiseptica и для B. henselae [76, 9]. Например, в штаммах B. bronchiseptica комплекса IV, выделеных от людей, отсутствовали или были сильно изменены за счет дивергенции более 230 генов по сравнению со штаммами комплекса I, выделенных от животных, то есть наблюдалась компактизация генома, что ранее относили только к штаммам B. pertussis и B. parapertussis, выделенных от человека [76]. Важно, что в 8 из 13 изученных штаммов B. bronchiseptica комплекса IV был утрачен ген dnt, кодирующий внутриклеточный дермонекротический токсин Dnt, который активирует малую GTP-азу Rho. Предполагается, что Dnt, в конечном счёте, необходим для колонизации B. bronchiseptica верхних дыхательных путей поросят [27], хотя наиболее вероятно, что его роль в патогенезе не зависит от того, какой хозяин инфицирован бордетеллами. Наряду с частой потерей гена dnt, у штаммов B. bronchiseptica комплекса IV наблюдали высокий процент утраты гена коклюшного токсина рtx, который, как и ген dnt, всегда присутствует в штаммах B. pertussis. То есть, в этих случаях мы не наблюдаем даже намёка на то, что штаммы B. bronchiseptica комплекса IV теряют участки генома, адаптируясь к новой экологической нише (человеческому организму), и повторяя путь, пройденный B. pertussis. Иными словами, наблюдаемая утрата генов у штаммов B. bronchiseptica комплекса IV не носит адаптивного (к организму человека) характера.
Таким образом, очевидно, что утрата частей генома имеет место не только у «специалистов», но и у «генералистов», и что компактизацию геномов последних вряд ли можно объяснить повторением пути «специалиста» или адаптацией к новой экологической нише.
2. Оказалось, что редукция генома наблюдается не только у паразитов и эндосимбионтов, но и у свободноживущих микроорганизмов. Речь идёт о Prochlorococcus marinus, морской одноклеточной цианобактерии, численно доминирующей в фитопланктоне тропических океанов. Адаптированные к высокой степени освещённости организмы (HL) имеют самый маленький геном из известных у автотрофов (1 657 990 н.п., 1,716 генов). Редукция генома у HL штаммов привела к резкому снижению содержания в ДНК G+C и утрате репаративных генов, ответственных за корректирующую функцию [41, 85]. Судя по всему, это первый документированный случай компактизации геномов у свободноживущих микроорганизмов [41, 85, 42, 51].
Также показателен пример редуктивной эволюции у представителей рода Burkholderia. Редуктивный характер изменений генома показан не только для высокопатогенного B. mallei, но и для свободноживущего сапарофита B. thailandensis. При этом характер делеций у B. mallei и B. thailandensis различен. Эти данные означают, что в ходе эволюции от общего предшественника, близкого к B. pseudomallei, геном B. thailandensis утрачивал ДНК, не будучи паразитом. Поскольку и паразит -- B. mallei, и сапрофит -- B. thailandensis движутся по пути компактизации геномов, за счёт различий в условиях их существования можно пытаться отнести только тип делеций, но не направление эволюции геномов этих бактерий [73, 55].
Таким образом, наблюдается редукция геномов не паразитических микроорганизмов B. thailandensis и P. marinus.
Следовательно, учитывая редукцию геномов свободноживущих непатогенных бактерий, паразитизм или эндосимбиотизм не могут считаться единственной и главной причиной редуктивной эволюции.
3. Почему-то подразумевается, что гены, не поддерживаемые естественным отбором, должны утрачиваться. Нам не известны экспериментальные доказательства приобретения селективного преимущества за счёт утраты нейтральной генетической информации. Есть доказательства противоположного: отсутствия селективных преимуществ в результате потери генетического материала [98]. Кроме того, существует огромное количество данных о сохранении в геномах не кодирующей ДНК или генов, не оказывающих влияние на фенотип, включая повторы различного типа, IS-элементы, псевдогены и т.п. Короткие повторяющиеся последовательности в различном количестве копий сохранились даже в редуцированном до минимума геноме M. genitalium [104], а псевдогены и не кодирующие повторы (хотя и в очень незначительном количестве) обнаружены в одном из самых маленьких из известных на настоящий момент геноме Nanoarchaeum equitans -- единственного паразита среди архей и единственного представителя нового царства наноархей [109]. Участки геномов, занятые повторами различного типа, IS-элементами, псевдогенами никак не могут сохраняться под влиянием естественного отбора в его классическом понимании, но не утрачиваются.
4. И, наконец, потеря того или иного гена в огромном большинстве случаев присходит не как таковая, а в составе фрагмента ДНК, включающего утрачиваемый ген. Более того, этот процесс часто многоступенчатый: сначала ген инактивируется за счёт мутации, а затем псевдоген утрачивается в составе более крупного фрагмента ДНК за счёт делеции [10, 97]. То есть, правильнее было бы говорить не о том, что ген стал не нужен в создавшихся условиях (например, паразитизма), а фрагмент ДНК, содержащий уже псевдоген и, возможно, другие гены, стал почему-то не нужен. Получается, что в этой ситуации естественный отбор не способствует сохранению некого фрагмента ДНК, не кодирующего ранее существовавший признак. На что же ориентирован естественный отбор, удаляющий фенотипически не значимый псевдоген? Учитывая экспериментальный факт отсутствия селективных преимуществ в результате потери генетического материала [98], это не понятно и не укладывается в простую картину утраты гена «за ненадобностью».
Если отвлечься от бактерий, то можно отметить, что противоположно направленные процессы редукции и экспансии геномов происходят и у одноклеточных эукариотов [63], и у растений, и у насекомых, которые не являются ни эндосимбионтами, ни патогенными паразитами [см. 49, 20, 79, 80]. Масштабы этого явления гораздо большие, чем у бактерий. В результате процессов редукции и экспансии различия в общем количестве ДНК в клетках растений разных видов достигли 1000 раз, а у эукариотических организмов отличия доходят до 200 000 раз [56].
Следовательно, концепция редукции бактериальных геномов в связи с утратой значительной части генетической информации «за ненадобностью», как не поддерживаемой естественным отбором, вряд ли вообще что-то объясняет.
II. Молекулярные механизмы потери и приобретения генетического материала
II.1. Нуклеотидные последовательности в точках рекомбинации при интеграциях и делециях.
При изучении эволюции микроорганизмов нет возможности исследовать промежуточные формы, -- ископаемых остатков геномов не существует. В распоряжении исследователей имеются только современные геномы, которые, однако, содержат определённую информацию о происходивших событиях. Как интеграция привнесённого сегмента ДНК в резидентный геном, так и делеция участка генома -- события, которые оставляют «молекулярный след». Таким «следом» являются новые нуклеотидные последовательности, образующиеся в точках рекомбинационного взаимодействия (recombination joints). Анализируя такие «следы» можно сделать вывод о природе взаимодействий, приведших к рекомбинации, за счёт которой в геном попал новый участок ДНК или из генома был удалён какой либо сегмент ДНК. Возможность анализировать «молекулярные следы» рекомбинационных событий появилась совсем недавно благодаря достижениям сравнительной геномики, после того как были полностью сиквенированы геномы многих микроорганизмов, их родственников и делеционных мутантов. Было установлено, что по краям вновь интегрированного сегмента ДНК могут находиться а) IS-элементы, б) гены тРНК (с одной стороны) и гены интеграз (с другой), в) повторяющиеся последовательности, которые входят в состав сайта интеграции интегрона, г) ДНК профагов.
В точках рекомбинационного взаимодействия, на месте делетированнного материала обнаруживаются IS-элементы (МГЭ) или повторяющиеся последовательности.
Следовательно, внедрения генетического материала и делеции обусловлены наличием в геномах перечисленных последовательностей, являющихся сайтами предпочтительной рекомбинации.
II.2. Сайты интеграции (tРНК, интегроны, IS-элементы, короткие повторы).
Почему рекомбинация в этих сайтах предпочтительна?
Одним из доминирующих механизмов внедрения нового генетического материала (например, геномных островов, островов патогенности) в ДНК-мишень является интеграция в сайты, находящиеся в генах тРНК и тмРНК. Гены тРНК имеют три сайта интеграции, два из которых симметричны, а один -- нет. Интегразы, связывающиеся с этими сайтами, строго специфичны, т.е. взаимодействуют либо с симметричными, либо с несимметричными сайтами [82, 115].
В эти сайты могут интегрировать геномные острова, плазмиды, геномы умеренных бактериофагов. Существует много примеров использования генов тРНК в качестве сайтов интеграции, но в данном контексте в качестве фрагментов интегрировавших по этому механизму, можно привести геномные острова B. henselae и уникальные участки генома B. quintana. 62% генетического материала B. henselae, отсутствующего у B. quintana, входит в состав 4 сегментов генома, 3 из которых являются геномными островами, а 4-й -- профагом. Каждый из островов B. henselae фланкирован с одной стороны генами лейциновой тРНК, а сдругой -- генами интеграз. На месте этих островов и профага в геноме B. quintana находятся некодирующие остатки генома профага. Дополнительный небольшой уникальный для B. henselae участок генома содержит последовательность, сходную с островом патогенности Photorabdus luminescens. (Photorabdus luminescens является симбионтом нематод, которые инфицируют насекомых -- вредителей растений; нематоды отрыгивают бактерий, которые, продуцируя токсин, убивают насекомых). Участки генома, уникальные для B. quintana, содержат ген, гомологичный гену эффектора YopP иерсиний и ген секреторного белка для гемолитического токсина азотфиксирующей почвенной бактерии Sinorhizobium meliloti. Оба этих гена сцеплены с генами тРНК [9].
Анализ сиквенированных геномов показывает, что локализация генов тРНК имеет определённую специфичность. Так, у энтеробактерий эти гены относительно равномерно распределены по всему геному, тогда как у бацилл они сгруппированы в блоки и расположены в первой трети генома. Соответственно, районы интеграции генетического материала в гены тРНК у бактерий разных таксономических групп будут отличаться.
Интегроны представляют собой сложные генетические элементы, предназначенные для захвата генов и содержащие ген интегразы, сайт интеграции для привносимых фрагментов ДНК и промотор для экспрессии генов (Рис.3). Сайт интеграции содержит инвертированные повторы, которые узнаются интегразой. Особенно интересно то, что интегроны очень древние генетические элементы, и хотя чаще всего они захватывают кассеты с генами антибиотикоустойчивости, сами интегроны сформировались задолго до эры применения антибиотиков [см. 91-93] Кроме генов антибиотикоустойчивости [64, 90] кассеты, захватываемые интегронами и суперинтегронами, могут содержать гены, кодирующие факторы патогенности [106, 74], гены метаболизма [19, 91], или гены, кодирующие рестрикционные ферменты [91, 103]. Различные геннные кассеты содержат интеграционные сайты (attC), которые не гомологичны друг другу. В большинстве исследованных случаев интегроны бактерий различных видов, даже принадлежащих одному роду, содержат разные генные кассеты. Локализация интегронов (например, в геномах бактерий рода Vibrio) может быть различной, но очевидно наличие предпочтительных сайтов [92]. Перечисленные данные с очевидностью указывают на предетерминированность захвата генетического материала в определённые специализированные сайты (платформы интегронов) за счёт сложного и древнего механизма сайт-специфической рекомбинации.
Рис. 3 - Структура (А) и работа (Б) интегрона
Интеграция многих МГЭ зависит от наличия в сайте-мишени повторяющихся последовательностей. Так, например, предпочтительной мишенью (сайтом узнавания и связывания) для транспозаз в геномах микроорганизмов различных видов оказались внегенные повторяющиеся палиндромы REP [101]. Однако в большинстве случаев специфичность интеграции хотя и зависит от нуклеотидной последовательности мишени, но не является строгой [62]. Итак, МГЭ могут интегрировать в сайты, образованные повторами, из которых состоят также сайты интеграции в генах тРНК и в интегронах. Остаётся выяснить, как распределяются в геномах сами повторы.
II.3. Распределение IS-элементов и повторяющихся последовательностей в геномах.
Существует ли специфика в присутствии повторов и IS-элементов в ДНК различных бактерий и их распределении по геному? Повторы и IS-элементы могут служить сайтами интеграции и, не находясь в структуре интегрона. Эти же элементы служат горячими точками рекомбинации при образовании делеций.
Например, в геноме M. leprae присутствует очень мало IS-элементов, но большое количество повторов трёх типов RLEP, REPLEР и LEPREP. Участки генома M. leprae, гомологичные геному M. tuberculosis, распределены по геному M. leprae в ином порядке, нежели в M. tuberculosis. Отличия в расположении этих участков и мозаичность генома M. leprae в целом, по-видимому, связаны с наличием по флангам сегментов, гомологичных с M. tuberculosis, указанных диспергированных повторов и генов тРНК, которые вызвали разнообразные геномные перестройки [34].