Статья: Механизмы повреждения эритроцитов при токсическом действии метгемоглобинобразователей

Механизмы повреждения эритроцитов при токсическом действии метгемоглобинобразователей

Филиппова О.Н.

Шперлинг И.А.

Рогов О.А.

Сапрыкина Э.В.

Рязанцева Н.В.

Новицкий В.В.

Аннотации

Исследованы структурные свойства липидного компонента эритроцитарной мембраны у крыс линии Wistar при метгемоглобинемиях, индуцированных однократным введением нитрита натрия и солянокислого фенилгидразина в дозах DL50. Показано, что при метгемоглобинемиях увеличивается содержание холестерина, лизофосфатидилхолина, сфингомиелина, фосфатидилсерина, снижается уровень фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина, в мембране эритроцитов возрастает микровязкость липидного матрикса. Степень выявленных изменений зависит от вида ксенобиотика и продолжительности периода метгемоглобинемии.

Ключевые слова: метгемоглобинемия, эритроцит, мембрана, липиды, микровязкость. липидный эритроцитарный мембрана

Structural properties of lipid component of erythrocyte membrane of Wistar rats with methemoglobinemia were investigated after one injection of sodium nitrite and phenylhydrazin chloride in DL50 dose. It was shown that in methemoglobinemia cholesterol, lysophosphatidylcholine, sphingomyelin, phosphatidylserine levels are increased and phosphatidylcholine and phosphatidyletanolamine levels are decreased, and an increase of microviscousity of erythrocyte membrane lipid matrix was elevated. The degree of the elucidated changes depends on a xenobiotic and a time of methemoglobinemia period.

Key words: methemoglobiemia, erythrocyte, membrane, lipid, microviscousity.

Введение

Большая распространенность метгемоглобинобразователей в среде обитания человека определяет высокую частоту отравлений данными веществами и неблагоприятные исходы. Расширяющееся с каждым годом внедрение химических соединений в различные виды промышленности, быта и науки создает условия для повышенного образования метгемоглобина (MtHb) в крови при действии окислителей, амидо- и нитропроизводных бензола, анилина, гидразина и его производных, окислов азота, нитритов натрия и калия [10]. Отравления метгемоглобинобразующими ксенобиотиками приводят к развитию в постинтоксикационном периоде полиорганных осложнений. Значительную роль в генезе данных расстройств имеют изменения в системе красной крови [9].

Интерес к всестороннему изучению патологических процессов, протекающих в эритроцитах при воздействии на организм метгемоглобинобразователей, остается весьма значимым, поскольку гипоксия является ведущим синдромом данной патологии, а эритроцит представляет собой клетку, во многом определяющую кислородный статус организма [11]. Ранее проведенные исследования позволили установить, что реакция циркулирующих эритроцитарных клеток при токсических метгемоглобинемиях характеризуется нарастанием их полиморфизма, а также нарушением функциональных свойств красных кровяных клеток [9]. Между тем остаются неясными основные патогенетические пути развития нарушений периферического звена эритрона при остром воздействии метгемоглобинобразователей. Учитывая важную роль липидного компонента мембраны эритроцита в обеспечении метаболической и функциональной полноценности красных кровяных клеток, целью настоящего исследования явилось определение особенностей фракционного состава и микровязкостных свойств липидного матрикса мембраны эритроцитов (МЭ) при токсическом действии метгемоглобинобразователей.

Материал и методы

Эксперименты проведены на 134 крысах-самцах линии Wistar массой 190--250 г. Метгемоглобинемию моделировали однократным внутрибрюшинным введением 0,6%-го раствора нитрита натрия (НН) в дозе 90 мг на 1 кг массы животного (DL50) (64 крысы) и 2%-го раствора солянокислого фенилгидразина (ФГ) в дозе 150 мг на 1 кг массы животного (DL50) (55 крыс). Контрольную группу составили 15 интактных животных. Количество животных в каждой группе - не менее 6.

Забор крови у экспериментальных животных осуществляли под эфирным наркозом из хвостовой вены через 1,5 ч, 1, 3, 5, 7, 13 и 21 сут после введения НН и ФГ. Кровь стабилизировали гепарином (50 ЕД/мл). Все вмешательства проводили с соблюдением принципов Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными.

Уровень MtHb в крови определяли по методу М.С. Кушаковского [7]. МЭ выделяли методом, основанным на феномене гипоосмотического гемолиза клеток. Для этого эритроцитарную взвесь трижды отмывали 10 ммоль раствором трис-HCl-буфера (pH = 7,4) и 145 ммоль NaCl, центрифугируя в течение 10 мин при 3 000 об./мин. Клеточную взвесь гемолизировали в течение 30 мин при 0--4 С, добавляя 20-кратный объем гемолизирующей среды (10 ммоль трис-HCl-буфера (pH = 7,4) и 40 ммоль ЭДТА). Гемолизат центрифугировали при 15 000 об./мин в течение 20 мин, надосадок удаляли. Затем мембранную взвесь трижды отмывали 10 ммоль раствором трис-HCl-буфера (pH = 7,4) путем центрифугирования при 15 000 об./мин в течение 20 мин. В мембранной суспензии микробиуретовым методом определяли содержание белка.

Получали липидный экстракт, определяли содержание общих липидов и фосфолипидов. Препаративное разделение нейтральных липидов и фосфолипидов МЭ проводили методом тонкослойной хроматографии [2] в системах гептан - диэтиловый эфир - этилацетат (80 : 20 : 1,5 соответственно) и хлороформ - метанол - вода (32 : 12,5 : 2 соответственно) соответственно на пластинах "Sorbfil". Идентификацию фракций липидов осуществляли с использованием стандартов "Sigma".

Измерение собственной флуоресценции теней эритроцитов, а также определение спектральных характеристик взаимодействия МЭ с флуорофором пиреном проводили на спектрофлуориметре MPF-4 ("Hitachi", Япония). Измерения проводили в среде следующего состава: NaCl - 145 ммоль, трис-HCl-буфер - 10 ммоль (pH = 7,4). Раствор пирена (растворитель - этанол) добавляли в кювету с тенями эритроцитов (содержание белка - 0,3 мг/мл) до конечной концентрации 10 мкмоль, инкубировали в течение 10 мин при постоянном помешивании. Для оценки микровязкостных свойств липидной фазы и гидрофобного объема МЭ рассчитывали коэффициент эксимеризации пирена I470/I370, равный отношению максимумов интенсивностей флуоресценции эксимерной формы зонда к мономерной при длине волны возбуждающего света в = 340 нм [5].

Анализ данных проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и U-критерия Манна--Уитни. Числовые значения полученных результатов представлены в виде X m, где X - среднее значение, m ? ошибка среднего.

Результаты и обсуждение

После введения НН у экспериментальных животных уровень MtHb в крови был повышен в течение первых суток. При этом максимальные его значения были зарегистрированы через 1,5 ч наблюдения - (51,95 1,59)% при (1,19 0,24)% в контроле (p 0,001).

В последующие сроки исследования (с 1-х по 21-е сут) уровень MtHb в крови у крыс соответствовал норме. Однократное введение крысам ФГ в дозе 150 мг на 1 кг массы тела приводило через 30 мин к резкому возрастанию концентрации MtHb в крови (до (22,31 1,10)%, p 0,001). Через 24 ч после введения ксенобиотика уровень MtHb сохранялся достоверно повышенным (p 0,001), составляя в среднем (7,50 0,19)%. В последующем величина данного показателя постепенно снижалась и с 3-х по 21-е сут эксперимента уже достоверно не отличалась от нормы (p > 0,05).

Исследование абсолютного содержания липидов, их фракционного состава в эритроцитарной мембране у экспериментальных животных после однократного введения НН и ФГ выявило признаки существенной модификации липидной фазы в мембране красных кровяных клеток.

Так, после токсического действия НН в острый период метгемоглобинемии (через 1,5 ч после введения ксенобиотика) уровень общих липидов составлял лишь 70% от соответствующего показателя в контрольной группе, содержание общих фосфолипидов в МЭ у подопытных крыс было снижено на 34% от контрольного уровня (табл. 1). Изменение количественного содержания липидов в этот период эксперимента сопровождалось перераспределением фракционного состава липидного компонента мембраны красных клеток крови. В эритроцитарной мембране у животных опытной группы регистрировалось снижение уровня общих фосфолипидов на 24% по сравнению с их содержанием в норме на фоне достоверного (р < 0,001) увеличения (в 1,6 раза) содержания фракции эфиров холестерина (рис. 1,а). При оценке фракционного состава фосфолипидов в мембране красных кровяных клеток обращало на себя внимание достоверное (р < 0,001) увеличение содержания лизофосфатидилхолина - в 3,2 раза, сфингомиелина - на 43% (р < 0,01) и фосфатидилсерина - на 11% (р < 0,05), тогда как уровень фосфатидилэтаноламина и фосфатидилхолина, напротив, был снижен по сравнению с их содержанием в МЭ у интактных животных на 39 и 16% соответственно (р < 0,001) (табл. 1).

Практически аналогичный характер модификации липидного спектра МЭ был выявлен у животных через 1 сут после введения НН. Однако через 3 сут после воздействия ксенобиотика были обнаружены существенные изменения фракционного состава нейтральных липидов мембраны эритроцитов: на долю фракции общих фосфолипидов приходилось (28,91 1,03)%, что оказалось в 1,3 раза ниже их содержания у животных контрольной группы (р < 0,001). Обращало на себя внимание также достоверное увеличение доли фракции холестерина и его эфиров. Указанные изменения приводили к возрастанию (в 1,7 раза) средних значений величины соотношения холестерин: фосфолипиды ((1,48 0,06)% при (0,86 0,05)% в контроле, р < 0,001). Накопление холестерина в МЭ чревато увеличением микровязкости бислоя, нарушением латеральной диффузии рецепторов, ионного транспорта, что делает МЭ менее приспособленной к выполнению своих функций [8].

Таблица 1

Содержание общих липидов, общих фосфолипидов и их фракционный состав в мембране эритроцитов у крыс после однократного внутрибрюшинного введения нитрита натрия в дозе 90 мг на 1 кг массы животного (X m)

Примечание. Здесь и в табл. 2: р - достоверность различий величин показателей по сравнению с соответствующими значениями в контрольной группе.

Рис. 1. Фракционный состав общих липидов эритроцитарной мембраны у крыс после однократного введения нитрита натрия в дозе 90 мг на 1 кг массы животного (а) и солянокислого фенилгидразина в дозе 150 мг на 1 кг массы животного (б): * - достоверность различий величин показателей по сравнению с соответствующими значениями в контрольной группе

Модификация фосфолипидного спектра мембраны красных кровяных клеток имела аналогичный характер по сравнению с предыдущими периодами эксперимента. В последующие сроки наблюдения отмечалась отчетливая тенденция к восстановлению соотношения изучаемых параметров, однако признаки дезорганизации липидного состава мембраны эритроцитов сохранялись вплоть до 13-х сут после начала эксперимента.

Аналогичный характер изменений липидного бислоя МЭ был отмечен у животных после введения ФГ, наиболее выраженных в острый период метгемоглобинемии. Обращало на себя внимание снижение абсолютного количества общих липидов и фосфолипидов, относительного содержания фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина и общих фосфолипидов при одновременном увеличении доли холестерина и его эфиров, лизофосфатидилхолина, сфингомиелина и фосфатидилсерина (табл. 2, рис. 1,б). Следует отметить, что нарушения липидной фазы (большей степени выраженности, чем при действии НН) сохранялись в течение всего периода наблюдения (до 21-х сут). По всей видимости, этот факт был связан со спецификой влияния солянокислого ФГ, являющегося более мощным прооксидантом в отличие от НН [1, 12].

Таблица 2

Содержание общих липидов, общих фосфолипидов и их фракционный состав в мембране эритроцитов у крыс после однократного внутрибрюшинного введения солянокислого фенилгидразина в дозе 150 мг на 1 кг массы животного (X m)