Федеральный исследовательский центр Тюменский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук,
Международный опыт генотипирования овса (аналитический обзор)
Кочнева Дарья Алексеевна младший научный сотрудник
Таутекенова Азия Кайсаровна младший научный сотрудник лаборатория геномных исследований в растениеводстве
Россия, Тюмень
Аннотация:
Овес (Avena sativa L.) считается одной из важнейших сельскохозяйственных культур в мире. Российская Федерация является крупнейшим производителем овса в мире, также имеется собственная коллекция сортов овса, созданная Всероссийским институтом генетических ресурсов имени Н. И. Вавилова. Для поддержания производства овса необходимо постоянное генетическое улучшение. Для этого в настоящее время отдаются предпочтения современным методам генетического анализа - генотипированию овса с молекулярными маркерами. Целью данной работы служит объединение информации о имеющихся международных коллекциях образцов овса, а также рассмотрение работ по его генотипированию.
Ключевые слова: Овес, генотипирование, генетические ресурсы растений, молекулярные маркеры, секвенирование, SNP.
Abstract
INTERNATIONAL EXPERIENCE OF OAT GENOTYPING (ANALYTICAL REVIEW)
Kochneva Darya Alekseevna Junior Researcher
Tautekenova Aziya Kaisarovna Junior Researcher Laboratory of Genomic Research in Crop Production Federal Research Center Tyumen Scientific Center of the Siberian Branch of the Russian Academy of Science Russia, Tyumen
Oats (Avena sativaL.) is considered one of the most important agricultural crops in the world. The Russian Federation is the largest producer of oats in the world, and there is also its own collection of oat varieties created by the N. I. Vavilov All-Russian Institute of Plant Genetic Resources. Continuous genetic improvement is necessary to maintain oat production. For this purpose, preferences are currently given to modern methods of genetic analysis - genotyping of oats with molecular markers. The purpose of this work is to combine information about the existing international collections of oat samples, as well as to review the work on its genotyping.
Keywords: Oats, genotyping, plant genetic resources, molecular markers, sequencing, SNP.
Введение
Овес (Лувпа 8аИуа Ь.) - является аллогексаплоидной (2п=6х=42) зерновой культурой, которая занимает седьмое место в мировом производстве зерновых после пшеницы, кукурузы, риса, ячменя, сорго и проса [1, 2]. Зерно овса используется в сельскохозяйственных нуждах как корм для животных, также используется как источник питательных веществ для человека. Также в зернах содержатся растительные белки, жиры, витамины (В, В2, РР, Е), пищевые волокна и различные минеральные вещества. Поэтому из овса получают крупы, толокно и муку, которые можно использовать, как и в детском питании, так и при диетическом питание [3].
Для производства овса нужен прохладный и влажный климат, поэтому в странах с умеренным климатом выгодно выращивать овес. Также овес адаптирован к различным типам почв. Основными странами по производству овса являются Россия, Канада, Соединенные Штаты, Финляндия и Польша. К самым крупным производителям овса относят Нидерланды, Швейцарию, Западной Германию, Соединенные Королевства, Ирландию, Швецию и Францию [1].
Овес (Лувпа $ай\а Ь.) является сельскохозяйственной культурой, которая требует постоянного генетического улучшения для сельскохозяйственных потребностей и промышленного производства. Для решения подобной задачи подходит генотипирование. Но с этим имеются некоторые проблемы. Генотипирование затруднено из-за присутствия гомеологичных субгеномов, которые возникают в результате полиплоидии во время клеточного цикла. При полиплоидии организм может иметь более одной пары гомологичных наборов хромосом. Для этого перед генетиками ставится задача в поисках нужных маркеров овса. Маркеры необходимо отфильтровать, для того чтобы исключить те варианты маркеров, которые смешиваются с несколькими локусами [2]. Геномные исследования овса также усложняются из-за размеров и сложности гексаплоидного генома и различных хромосомных перестроек. Все эти нюансы сказываются на скорости изучения генома по сравнению с другими культурами[4].
Генотипирование -- это методологический процесс определения аллельного содержания локусов в данном геноме, так называемый генотип, который помогает выявить различия между двумя особями или аллельным частотам среди особей популяции. В большинстве случаев генотипирование образовано на сравнительном анализе последовательностей ДНК определенного субъекта с применением имеющихся технологий молекулярных маркеров. Генотипирование -- это важнейший шаг на пути к генетических анализам, к анализам молекулярной селекции сельскохозяйственных культур, а также штрихкодированию уникальных биологических биоматериалов [5].
Начало изучения генетики и генотипирования овса началось в XX веке и было связано с вопросами систематики и филогении рода Лувпа. Сначала изучали наследование морфологических признаков генеративных органов: окраска и опушение цветковых чешуй. Позже был исследован и идентифицирован целый ряд генов, отвечающий за устойчивость и восприимчивость к различным болезням и вредителям [6].
Изучением овса занимались ученые из разных стран. Для создания мировой коллекции овса они обменивались друг с другом образцами, при объединении коллекций не было определенной систематизации, а также встречалось дублирование сортов. В исследовании Diederichsen А. по оценке дублирования Канадской коллекции овса (Лувпа $ай\аЬ.) из 339 образцов коллекции, 243 были отнесены к Швеции, 68 из Финляндии, 30 из Дании и 7 из Норвегии [7]. В 1966 г. была разработана стандартизированная система номенклатуры генов овса [8]. На основании новой номенклатуры генов уже в 1978 г. был опубликован список генов овса. Это был первый документ, который собрал все определенные гены овса [9]. В 1992 г. список был дополнен [10].
На сегодняшний день к методам генотипирования, которые применимы к злаковым культурам, можно отнести следующие группы методов:
1. содержащие рестрикцию и электрофорез;
2. основанные на амплификации вариабельных локусов;
3. основанные на гибридизации;
4. основанные на секвенировании.
В последнее время чаще всего для изучения генетики и полиморфизма овса разрабатывают методы такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР) с последующим электрофорезом или секвенированием.
Среди методов ПЦР для зерновых культур получил распространение анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов полимеразной цепной реакции (PCR- RFLP). Суть данного метода заключается в расщепление копий ДНК специальный рестрикционными ферментами, в результате чего получаются отдельные полиморфные фрагменты, которые буду использоваться в последующем как маркеры [11]. Дальше маркеры будут использоваться для маркирования генома и участков локусов на электрофореграмме [6]. Полученные электрограммы можно будет расшифровать при помощи биоинформатических программ.
Существуют и другие методы: случайная амплификация полиморфной ДНК (RAPD), полиморфизм длины амплифицированного фрагмента (AFLP), полиморфизм микросателлитных участков ДНК, рибосомальных ДНК и т. д. [6].
Как говорилось выше, генотипирование возможно и еще одним методом - секвенирование частичных представленый генома. Такое генотипирование принято называть генотипирование путем секвенирования (GBS - genotyping-by-sequence). Суть GBS заключается в том, что сначала геном необходимо расщепить на более мелкие фрагменты при помощи одного и нескольких рестрикционных ферментов, затем полученные фрагменты будут секвенированы параллельными высокопроизводительными методами. Основываясь на данных полученных после секвенирования, вызов платформы для генотипирования SNP может быть выполнено благодаря различным пайплайнам биоинформатики [2].
Эти методы могут использоваться как в системе, так и отдельно каждый. Все зависит от целей исследователей [12, 13]. Особое место занимает электрофорез запасных белков, который имеет особую практическую значимость для сельского хозяйства [14, 15]. SNP - (single-nucleotide polymorphism) маркеры однонуклеотидного полиморфизма. В клетках точечные мутации возникают в результате изменений в одном нуклеотиде, поэтому техника проведения анализа с использованием данного маркера заключается в определение полиморфизма по одному нуклеотиду [16]. Данный вид ДНК-маркеров в настоящее время активно используется в генетике и селекции сельскохозяйственных культур. А сам GBS, по сути, это платформа для генотипирования SNP, основанная на секвенировании следующего поколения (NGS) [17].
Благодаря GBS в целях для сельского хозяйства уже были проведены следующие работы: насыщение уже имеющихся генетических карт сельскохозяйственных культур, проведена геномная селекция пшеницы, проведено генетическая упорядоченность черновой последовательности генома ячменя, а также описана характеристика генома пшеницы и ячменя и разнообразия зародышевой плазмы кукурузы и проса [2].
За последнее время методы генотипирования испытали существенные изменения, увеличился уровень машинного производства, разработаны новые современные методы биоинформатики. Базы данных, содержащих последовательности ДНК и методы генотипирования, постоянно увеличивают рост, тем самым ускоряя и упрощая работу. На данный момент нет идеального метода генотипирования, в каждом есть свои преимущества и недостатки [18]. Поэтому методы генотипирования могут различаться в зависимости от поставленной задачи и даже в зависимости от вида зерновых культур. Возможна такая ситуация, что метод генотипирования, пригодный для пшеницы, может не подходить для овса. И как раз задачей для генетиков и биоинформатиков является нахождение таких методов, которые подходили для той или иной зерновой культуры. А так как среди зерновых культур овес с генетической точки зрения изучен довольно мало, в настоящее время отдается предпочтение изучению именно этого вида. Также идет подбор и изучение современных методов генетического анализа - генотипирование овса при помощи молекулярных маркеров.
Объекты и методы исследований.
В мировом генетическом банке хранится около 220 000 образцов овса рода Avena [19]. Самой большой коллекцией овса, содержащий 27 000 образцов является Канадский национальный генетический банк семян (Plant Gene Resources of Canada) [7]. Из которых 10 105 образцов приходится на гексаплоидный культивируемый овес Avena sativa L. [20].
Польская коллекция образцов овса, хранится в Национальном центре генетических ресурсов растений и составляет 2 500 образцов, из которых более 80% относятся к виду Avena sativa [19].
Изучением генетики овса в России занимается Всероссийский институт генетических ресурсов имени Н. И. Вавилова (ВИР). В основу создания генетической коллекции были положены списки генов, опубликованных в 1978 г. и 1992 г. Коллекция постоянно пополняется данными со всего мира об образцах с идентифицированными генами. В 1997 г. уже была опубликована коллекция образцов с данными о сортах, образцах культурных и дикорастущих видов, где были выявлены один или несколько идентифицированных генов. Описанные гены контролируют морфологические, агробиологические и биохимические признаки овса. Так как изучение генетики овса в основном было направлено на устойчивость к различным патогенам, поэтому больше всего представлено образцов с гена устойчивости к головне, мучнистой росе, стеблевой и корончатой ржавчине. В коллекции овса ВИР находится более 600 образцов культурных и дикорастущих видов с более чем 200 идентифицированных генов [6].
Результаты исследований
Как известно, в селекции растений можно использовать ДНК-маркеры, например RFLP-маркеры (restriction fragment length polymorphism-маркеры), но для овса существует не так уж и много маркеров. Имеются отчеты об успешном применении на овсе маркерах, основанных на микросателлитных повторах (SSR) и маркерах ПЦР на основе интронов. Основная проблема - найти праймеры, которые буду полиморфными для овса. Эту задачу решают генетики по всему миру.
Jannink J.-L., Gardner S. W. из университета штата Айова решили заняться проблемой подбора ПЦР маркеров для работ с овсом. Для Avena sativa они создали дизайн для 32 маркеров, которые были сконструированы из последовательностей представленных в GenBank на четырех инбредных линиях овса. Практически все маркеры, кроме двух, показали хорошие результаты и смогли произвести амплификацию участков ДНК. Данные маркеры являются вида SSR [21].
Генотипированием мировой коллекции овса занимаются специалисты Института биологии и биотехнологий растений (г. Алматы) и Казахского национального университет им. аль-Фараби (г. Алматы). В данной работе представлено изучение генетического разнообразия овса с помощью ДНК-маркеров - SSR-маркеры (Simple Sequence Repeats). Ашимова А. Н. с соавторами прогенотипировали коллекцию овса из 163 сортов и линий Avena sativa L. и Avena byzantine с. Koch. Основная часть образцов была получена из мировой коллекции овса ВИР, представленная сортами из России, Украины, Беларуси, Канады, США, стран Южной Америки и Европы. Остальная часть коллекции была представлена образцами казахстанской селекции. генетический овес молекулярный
Был проведен метод ПЦР анализа с использованием 29 пар SSR-праймеров, но только 19 оказались полиморфными для изучаемых коллекций: AM1, AM3, AM14, AM22, AM25,AM31, AM56, AM87, AM102, AM112, MAMA1, MAMA2, MAMA3, MAMA4, MAMA5, MAMA 6, MAMA11, MAMA12, HVM67.
В результате анализа был выявлен высокий уровень генетического разнообразия между отечественными образцами и образцами из других регионов мира. Больше всего генетическое разнообразие наблюдается в коллекциях сортов Казахстана и Восточной Европы [22].
Канадские ученые в соавторстве с учеными из США и Австралии провели проверку работу по применению метода GBS для исследования овса. Задача заключалась в создание массива SNP и создания базы последовательностей, по которой можно было бы делать прогнозы SNP. Материалом для работы служили ткани корней, побегов, структуры пестика и зрелых зародышей. Всего было отобрано 20 сортов овса для создания геномной библиотеки кДНК (комплементарная ДНК). Работа проводилась на проверку преимуществ массива SNP, основанный на последовательностях кДНК. Также были представлены подробные биоинформатические пайплайны и как проводилась фильтрация SNP.