План

Лекция «Стафилококки, стрептококки»

План лекции

1. Исторический очерк

2. Классификация и характеристика возбудителя

     а) морфология возбудителя

     б) культуральные свойства

     в) физиология возбудителя

     г) антигенные свойства

     д) токсинообразование

3. Эпидемиология

     а) резистентность возбудителя в окружающей среде

4. Патогенез (пути и механизм заражения)

5. Микробиологическая диагностика

6. Профилактика и противоэпидемические мероприятия

СТАФИЛОКОККИ

I. Исторический очерк

     Стафилококк был обнаружен в 1878 г. Р.Кохом и в 1880 г. Л.Пастером в очагах гнойных поражений у человека. Л.Пастер, заразив кролика, окончательно доказал роль стафилококка как возбудителя гнойного воспаления. Название «стафилококк» дал в 1881 г. А.Огстон из-за характерного расположения скоплений клеток в виде гроздьев винограда от латинского staphyle – гроздь, coccus – зернышко, ягода. Подробно его свойства в 1884 г. описал Ф.Розенбах.

II. Классификация и характеристика возбудителя

     Семейство Microсоссасеае, род Staphylococcus включает около 40 видов, из них клинически значимых для человека около 8 видов: S. aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. saprophyticus, S. intermedius и др. Существует внутривидовая дифференциация S. aureus на фагогруппы и фаговары, что используется в реакции фаготипирования для выяснения источника заражения и путей передачи инфекции.

Морфология возбудителя

     Стафилококки – грамположительные кокки, которым в чистой культуре свойственно скопление в виде гроздьев винограда (т.к. они делятся во взаимоперпендикулярных плоскостях). Неподвижные, не образуют спор, могут образовывать микрокапсулу.

Культуральные свойства

     Факультативные анаэробы, хемоорганотрофы. Хорошо растут на простых питательных средах, в том числе на средах с 5-10% NaCl, что используется при изготовлении элективной среды – желточно-солевого агара (ЖСА). Температурный оптимум от +35 до +37оС, рН 6-8 (лучше слабощелочная реакция среды).

     На плотных средах образуют непрозрачные круглые (2-4 мм в диаметре) ровные колонии, выпуклые, непрозрачные, окрашенные в цвет липохромного пигмента (кремовый, желтый, оранжевый). Кроме S-форм колоний могут образовывать R-формы. На жидких средах дают равномерное помутнение, затем выпадает рыхлый осадок.

     Стафилококки чувствительны к анилиновым красителям (кристаллическому фиолетовому, бриллиантовому зеленому), йоду, что используется в местном лечении стафилококковых пиодермии (антисептики), а также эти красители входят в состав элективных сред для выделения энтеробактерий (среды Эндо, Плоскирева) для подавления роста грамположительных кокков.

     При росте на обычных средах стафилококки не образуют капсулы, однако при посеве уколом в полужидкий агар с плазмой или сывороткой большинство штаммов S. aureus образует капсулу. Бескапсульные штаммы в полужидком агаре растут в виде компактных колоний, капсульные – образуют диффузные колонии.

Физиология возбудителя

     Обладают высокой биохимической активностью, образуют различные ферменты, во многом определяющие патогенность. Стафилококки продуцируют каталазу, что защищает их от губительного действия производных кислорода, оксидаза отрицательные. Углеводы (глюкозу) ферментируют до кислоты без газа, разжижают желатин с образованием воронки, образуют сероводород. Способны образовывать коагулазу, что характерно для патогенных штаммов S. aureus., ДНК-азу, фосфатазу и расщеплять маннит в анаэробных условиях.

     Синтезируют каротиноидные пигменты (определяют золотистый, белый и другие цвета колоний), которые также защищают от оксидантов. Стафилококки часто характеризуются множественной устойчивостью к антибиотикам: β-лактамам, эритромицину, тетрациклинам, хлорамфениколу и др. Устойчивость к антибиотикам контролируется R-плазмидами (синтез β-лактамаз) или хромосомными мутациями (метициллино-резистентные стафилококки – MRS-штаммы).     

Антигенные свойства

     Антигенная структура очень сложная (более 50 типов антигенов), многие антигены обладают аллергенными свойствами. По специфичности антигены подразделяют на родовые (общие для всего рода), перекрестнореагирующие (антигены общие с изоантигенами эритроцитов, кожи и почки человека) вызывающие аутоиммунные заболевания, видовые и типоспецифические. Капсульный антиген находится в микрокапсуле.

     Видоспецифическими антигенами являются пептидогликан, тейхоевые кислоты, протеин А клеточной стенки золотистого стафилококка. Антигенными свойствами также обладают токсины.

Токсинообразование

     Особое место в ряду факторов патогенности стафилококков занимает комплекс секретируемых экзотоксинов и энтеротоксинов.

     Мембраноповреждающие токсины – α, β, γ, δ. Ранее их описывали как гемолизины, некротоксины, лейкоцидины, летальные токсины, т.е. по характеру их действия: гемолиз эритроцитов, некроз при внутрикожном введении кролику, разрушение лейкоцитов, смерть кролика при внутривенном введении. Однако оказалось, что такой эффект вызывает один и тот же фактор – мембраноповреждающий токсин. Он обладает цитолитическим действием в отношении различных типов клеток.

     Эксфолиативные токсины (А и В) разрушают межклеточные контакты в эпидермисе, что ведет к отслоению поверхностных структур эпидермиса (эксфолиации) и образованию изъязвляющихся пузырей – синдрому «ошпаренной кожи». Чаще встречается у новорожденных и детей младшего возраста.

     Экзотоксин, вызывающий синдром токсического шока (СТШ) является суперантигеном, что определяет механизм его токсического действия. Для СТШ характерны повышение температуры, снижение артериального давления и кожные высыпания. Его продукция связана с наличием профага (лизогенная конверсия). К продукции и секреции этого токсина способны более 50% штаммов S. aurеus.

     Энтеротоксины (A-F) относятся к гистотоксинам, вызывают пищевую интоксикацию. Энтеротоксины характеризуются антигенной специфичностью, высокой термостабильностью (выдерживают кипячение) и устойчивостью к протеолитическим ферментам. Энтеротоксины являются низкомолекулярными белками со свойствами суперантигенов – вызывают поликлональную стимуляцию Т-лимфоцитов с последующей гиперсекрецией цитокинов и вторичной интоксикацией. С синтезом энтеротоксинов связана способность стафилококков вызывать пищевые отравления типа интоксикации. Интоксикации чаще связаны с употреблением инфицированных стафилококками молочных продуктов.

     Ряд экзотоксинов и других структур стафилококков обладают аллергизирующим действием, обусловливая эффект развития ГЗТ. Наличие перекрестнореагирующих антигенов способствует развитию аутоиммунных процессов.

III. Эпидемиология

Резистентность возбудителя в окружающей среде

     Стафилококки широко распространены в природе, обнаруживаются на коже и слизистых оболочках человека, паразитируют у животных. На коже человека доминирующей микрофлорой являются стафилококки, особенно S. epidermidis. Колонизируют слизистую оболочку носа, зева, ротовой полости и других органов, являясь представителями нормальной микрофлоры человека.

     Среди не образующих спор бактерий стафилококки обладают наибольшей устойчивостью к внешним факторам. Хорошо переносят высушивание (более 6 месяцев) и остаются жизнеспособными и вирулентными неделями и месяцами (50-100 дней) в сухой мельчайшей пыли. В почве сохраняются до 75 дней, в воде – до 20 дней, в пищевых продуктах более 4 месяцев. Прямой солнечный свет убивает их лишь в течение многих часов, а рассеянный практически не действует. Устойчивы к высокой температуре: нагревание до 80°С выдерживают около 30 мин, низкие температуры переносят хорошо. Чувствительность к химическим дезинфектантам сильно варьирует, например, 3% раствор фенола убивает их в течение 15-30 мин, а 1% раствор хлорамина за 2-5 мин.

     Техногенные загрязнения внешней среды (сероводородсодержащий газ и др.) повышают патогенность стафилококков, в частности их персистентную активность.

IV. Патогенез (пути и механизм заражения)

     Только инфекции, вызываемые золотистым стафилококком, включают более 100 нозологических форм. Стафилококковые инфекции можно разделить на локальные и системные (генерализованные).

     Среди первых – фурункулы, панариции, мастит, гнойные осложнения раневых поверхностей.

     Среди вторых – сепсис (септицемия – «гнилокровие» с размножением возбудителя в крови, септикопиемия – сепсис с гнойными очагами – метастазами), стафилококковые пневмонии, осложнения после родов и операций, приводящих к синдрому токсического шока, остеомиелиты и др.

     Стафилококковые инфекции могут носить характер эндогенной инфекции (повреждение органов и тканей с проникновением возбудителя) или экзогенный характер, обусловленный различными механизмами и путями заражения:

     - фекально-оральным (алиментарный при стафилококковых отравлениях, контактно-бытовой),

     - аэрогенным (воздушно-капельный, воздушно-пылевой),

     - гемическим (парентеральный).

     Существенное значение имеет носительство патогенных стафилококков, чаще всего – на слизистой носа и зева, на втором месте – кожа. В условиях медицинских учреждений (родильные дома, хирургические стационары) и в закрытых коллективах особую опасность представляют резидентные (постоянные) носители, у которых наблюдается колонизация слизистых носа и зева и длительная персистенция стафилококков. Длительное носительство в определенной мере связано с дефицитом местного секреторного иммунитета (секреторного IgA в первую очередь) и хроническими очагами воспаления в организме.

Больной жалуется на частое появление фурункулов на лице, шее, плечах. В посеве гноя выявлены шаровидной формы микробы, располагающиеся скоплениями в виде гроздьев винограда и образующие на желточно-солевом агаре колонии, окруженные радужным венчиком. Какие микроорганизмы присутствовали в исследуемом материале?

Стафилококки

Диплококки

Микрококки

Стрептококки

VI. Микробиологическая диагностика

     Материалом для исследований служит: гной, кровь, отделяемое слизистой оболочки, спинномозговая жидкость, мокрота, моча, а при пищевых отравлениях – рвотные массы, промывные воды желудка.

     Взятие исследуемого материала зависит от предполагаемой локализации с учетом патогенеза и клинической картины болезни. Отбор патологического материала обычно выполняют стерильными квачами, которые вносят в пробирку с транспортной питательной средой для контроля стерильности (СКС). Из закрытых гнойных очагов материал берут с помощью шприца. Мокроту, мочу, рвотные массы и промывные воды желудка помещают в стерильные пробирки, банки. Кровь засевают непосредственно у постели больного в питательную среду на основе СКС в соотношении 1:10.

     Используют микроскопический, бактериологический и серологический методы.

     Микроскопический метод. Из исследуемого материала (исключая кровь) готовят мазки, окрашивают по Граму. Стафилококки имеют шаровидную форму, диаметром 0,5-1,5 мкм, грамположительные. Располагаются в мазках чаще всего в виде скоплений, напоминающих гроздья винограда. Также они могут располагаться в одиночку, парами, короткими цепочками.

     Микроскопическое исследование не позволяет идентифицировать стафилококки, но дает возможность сориентироваться в выборе питательных сред для выделения чистой культуры бактерий.

     Бактериологический метод. Включает выделение чистой культуры микробов из исследуемого материала и их идентификацию.

     Патологический материал высевают на кровяной агар (гемолиз), желточно-солевой агар (для выявления пигмента и лецитиназы) и инкубируют в термостате в течение 18-24 часов при температуре 37ºС.

     Через сутки изучают колонии, выросшие на питательной среде. Стафилококки образуют выпуклые непрозрачные колонии средней величины (1-3 мм), гомогенной структуры, гладкие с ровными краями.

     Колонии S. aureus на кровяном агаре окружены зоной гемолиза и часто имеют золотистый пигмент. На желточно-солевом агаре (ЖСА) колонии этого вида стафилококков окружены радужным венчиком помутнения среды, поскольку эти микроорганизмы способны продуцировать лецитиназу.

     Из изолированной колонии готовят мазок, окрашивают по Граму, микроскопируют. Оставшуюся часть колонии пересевают на скошенный мясопептонный агар и ставят его в термостат для увеличения количества выделенных микробов. Через 18-24 часов из микробного налета, образовавшегося на скошенном агаре, готовят мазок, окрашивают по Граму, микроскопируют. Убедившись, что культура выделенных микробов чистая, приступают к изучению комплекса их биологических свойств с целью видовой идентификации стафилококков.

     Для дифференцировки S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus ставят реакцию плазмокоагуляции, определяют ДНК-азную активность, фосфатазу, способность расщеплять маннит в анаэробных условиях, вызывать некроз кожи кролика.

     Реакция плазмокоагуляции. Появление желеобразного сгустка свидетельствует о наличии у изучаемого штамма фермента плазмокоагулазы.

     Определение ДНК-азы. На поверхность мясопептонного агара, содержащего ДНК, высевают штрихом суточную агаровую культуру стафилококка и помещают в термостат на 24 часа. После инкубации поверхность агара заливают 1 н раствором соляной кислоты. Если стафилококки продуцируют ДНК-азу, то вокруг колоний остается зона просветления.

     Определение фосфатазы. На чашку с фенолфталеиновым агаром высевают выделенную культуру стафилококка. Колонии, выросшие через 18-24 часов, обрабатывают парами аммиака. Появление розовой окраски колоний свидетельствует о положительной реакции.

     Для установления источника инфекции определяют фаговар патогенных стафилококков. Штаммы S. aureus различаются по чувствительности к стафилококковым фагам. Для типирования S. aureus используют международный набор из 23 умеренных фагов, которые разделены на 4 группы.

     Отношение стафилококков к фагам своеобразное: один и тот же штамм может лизироваться либо одним фагом, либо одновременно несколькими. Но поскольку чувствительность их к фагам является признаком относительно стабильным, фаготипирование стафилококков имеет важное эпидемиологическое значение. Недостаток этого метода состоит в том, что типированию поддается не более 65-70% S. aureus.

     В последние годы получены наборы специфических фагов и для типирования S. epidermidis.

     Серологический метод, как правило, применяется в диагностике затяжных, хронических форм заболевания. Информативными показателями является обнаружение антител к факторам патогенности стафилококков: токсинам, ферментам, тейхоевой кислоте и др. в РПГА и ИФА.

     Экспресс-диагностика направлена на обнаружение серологическими реакциями антигенов ферментов патогенности и токсинов стафилококка, а также определения tox-гена в ПЦР.

     Для определения энтеротоксигенности стафилококков используют несколько методов.

     1. Серологический – с помощью специфических антитоксических сывороток в реакции преципитации в геле обнаруживают энтеротоксин и устанавливают его тип. Серологический метод обнаружения энтеротоксина является наиболее простым и чувствительным.

     2. Биологический – внутривенное введение фильтрата бульонной культуры стафилококка котятам в дозе 2-3 мл на 1 кг веса или им дают остатки пищи или вводят в желудок через зонд выделенную культуру стафилококка. В случае наличия в исследуемом материале энтеротоксина у котят через 30-60 минут наступает рвота и понос.