8. Лабораторная диагностика
Лабораторная диагностика стафилококковых инфекций включает выделение возбудителя из гноя, мокроты, слизи из зева и носа, спинномозговой жидкости, фекалий и других биологических материалов. Наибольшую значимость имеет выделение культур стафилококков из стерильных в норме биосубстратов (кровь, СМЖ, моча, плевральный экссудат). Даже однократное выделение из крови S. aureus редко бывает результатом случайного загрязнения пробы. Для экспресс-идентификации золотистого стафилококка (S. aureus) применяют тест латекс-агглютинации с использованием коммерческих наборов частиц латекса, нагруженных AT. Серологические исследования (РПГА, ИФА) в диагностике стафилококковых инфекций принципиального значения не имеют. Выделенные штаммы стафилококков тестируют на резистентность к антибиотикам. Первым этапом определения чувствительности стафилококков к антибиотикам должен быть тест на чувствительность к оксациллину, который проводится дискодиффузионным методом. Стафилококки, проявляющие устойчивость к оксациллину, следует считать устойчивыми к действию всех в-лактамных антибиотиков, включая цефалоспорины. Для определения этиологической роли стафилококков в различных патологических процессах при жизни животных исследуют раневой экссудат, гной абсцессов, ран, молоко при маститах, выделения из половых органов при эндометрите, кровь из яремной вены при, септицемии. Из патологического материала готовят мазки, окрашивают фуксином Пфейфера, по Граму и микроскопируют. Одновременно делают посевы на кровяной и молочно-солевой агар в чашки Петри. Из выросших колоний производят отсев на МПА в пробирках для выделения чистой культуры и ее идентификации, ставят реакцию плазмокоагуляции с чистой культурой, для чего кровь кролика смешивают с 5%-ным раствором лимоннокислого натра. Полученную плазму разводят 1:4 физраствором, разливают по 0,5 мл в стерильные пробирки, засевают исследуемой культурой и ставят в термостат (37°С) на 3 ч. Реакцию учитывают через 1-2-3-18 ч. Свойство свертывать цитратную плазму крови кролика является характерной особенностью патогенных стафилококков. Наличие гемолитического токсина стафилококков определяют по следующей методике: выделенную культуру выращивают на казеиновом бульоне в течение 5 суток в эксикаторе с содержанием в атмосфере выращивания 20 % СО2. Затем культуру центрифугируют, верхний слой отсасывают, разводят физраствором 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, разливают в пробирки по 1 мл и добавляют по одной капле эритроцитов кролика, трижды отмытых физраствором и разведенных 1: 2. Пробирки выдерживают в термостате при 37°С 1 ч и такое же время при комнатной температуре и учитывают наличие гемолиза. Потенциальную гемолитическую способность стафилококков выявляют на кровяном агаре подобно КАМП - тесту. Дермонекротические свойства определяют на кроликах, для чего готовят взвесь стафилококков в физрастворе с содержанием в 1 мл 2 и 4 млрд. микробов и вводят внутрикожно кролику в выбритую кожу в дозе 0,1 мл. Наличие некроза в местах инъекции учитывают на четвертые сутки. Фаготипирование стафилококков проводят набором 22 типовых стафилококковых бактериофагов, которые по литическому родству составляют четыре группы. Размножают каждый тип фага на соответствующем штамме стафилококка. Для типирования выделенной культуры ее выращивают на глюкозном бульоне, затем высевают на глюкозный агар в чашку Петри, разделенную на четыре квадрата, в каждый из них наносят петлю бактериофага, принадлежащего к одной из указанных выше групп. С помощью фаготипирования можно идентифицировать стафилококки, выделенные из различных источников.
9. Дифференциация
Свойства Вирулентные Авирулентные
Гемолитические + -
Плазмокоагуляция + -
Дермонекротические + -
А-белок на поверхности + -
б - токсин + -
Разжижение желатины + -
Ферментация маннита + -
Образование пигмента Образуют золотистый или белый Образуют лимонно - жёлтый или белый
В настоящее время для идентификации стафилококков разработаны диагностические тест-системы, выпускаемые у нас в стране и за рубежом: ПБДС - пластины биохимические, дифференцирующие стафилококки, «STAPHYtest» («Lachema», Чехия), «API STAPH BioMerieux» (Франция), «Automicrobic VITEK» (США) и др. Система «STAPHYtest» представляет собой полистироловую пластину с 96 лунками. В них внесены высушенные реактивы, позволяющие с помощью восьми тестов идентифицировать все стафилококки и некоторые микрококки. При этом изучают способность утилизировать глюкозу, сахарозу, трегалозу, манит, наличие уреазы, фосфатазы, нитратредуктазы, образования ацетилметилкарбинола. На одной пластине идентифицируют 12 штаммов стафилококков. В ячейки планшета вносят по 0,1 мл бактериальной суспензии в физиологическом растворе, приготовленной из одной изолированной суточной колонии с d = 2-3 мм с плотной питательной среды (МПА, АГВ, кровяного агара). После инокуляции планшеты накрывают предохранительной плёнкой и инкубируют в течении 18-24 часов при температуре 37 °С. Видовую принадлежность стафилококков определяют в соответствии с таблицей для идентификации прилагаемой к инструкции. С помощью международного набора диагностических стафилококковых бактериофагов проведено фаготипирование коагулазоположительных штаммов стафилококков. Таким образом, полученные результаты позволили установить, что выделенные от больных коагулазоположительные стафилококки относятся ко всем трём видам, имеющим значение в патологии. Наибольшую часть (80,9 %) составляют штаммы S. аureus. Среди коагулазоотрицательных стафилококков преобладает S. epidermidis, который встречается почти в половине случаев, и примерно с одинаковой частотой - S. hominis, S. caseoliticus и S. auricularis. Они выделяются почти равномерно из разных видов патологического материала. (см таблицу) Система «STAPHYtest» может быть использована в практической работе лаборатории клинической микробиологии, однако для точной дифференциации некоторых видов коагулазоотрицательных стафилококков необходимо использовать дополнительные тесты.
Заключение
Стафилококк был и остаётся коварной инфекцией. Стафилококковые инфекции являются одной из наиболее актуальных проблем современного животноводства. Вопросы профилактики и лечения данного заболевания, несмотря на несомненные успехи, достигнутые в других отраслях ветеринарной науки и практики, остаются открытыми. В связи с его постоянной изменчивостью, следует уделять больше внимания изучению свойств возбудителя. Необходимы новые среды для выделения штаммов, резистентных к антибиотикам. Следует уделять больше внимания: морфологии, биохимическим и культуральным свойствам возбудителя. Необходимо тщательнее изучать изменчивость возбудителя и искать новые методы борьбы с ним. Принципиальное значение имеет профилактика инфекций, вызванных стафилококами. Следует соблюдать общеклинические мероприятия, контроль за средой и персоналом.