Материал: Лабораторная диагностика инфекционных болезней животных Методические указания к лабораторно-практическим занятиям для студентов факультета ветеринарной медицины и биотехнологии, направление подготовки 36.05.01 – Ветеринария

стафилококков образуются более мелкие и тусклые за счет разрушения капсулы ферментом, который диффундирует в толщу агара. Результат считают положительным.

Определение фибринокиназы основано на способности стафилококка лизировать фибринные сгустки свежей крови. Для испытания берут 0,5 мл бульонной суточной культуры стафилококков, вносят в 0,2 мл свежей человеческой плазмы или крови с 0,8 мл физиологического раствора. Затем осторожно перемешивают, предварительно добавив 0,5 мл 0,25% раствора хлористого кальция. Контролем в данной реакции служит пробирка со всеми теми же компонентами, но без бактерий. Пробирки помещаются в термостат при 37°C. В течение первых 15 минут наступает свертывание. C этого момента следят за ходом растворения образовавшегося сгустка. Обычно патогенные культуры обеспечивают полный фибринолизис в течение 24 часов.

Выявление лецитиназы. Культуру бактерий засевают штрихом на желточный агар с целью получения изолированных колоний. После инкубирования учитывают результат. Положительная реакция – зона помутнения вокруг колоний.

Определение протеина «А». Это белковое вещество, которое часто обнаруживают на поверхности клетки S. aureus и S. hyicus, обладает способностью неспецифически связывать Fc-фрагменты молекул JgG.

Отмытые центрифугированием эритроциты барана суспендируют в физиологическом растворе, смешивают с гемолизином, разведенным физиологическим раствором. Компоненты выдерживают при 37°С. Эритроциты отмывают центрифугированием и ресуспендируют в исходном растворе физиологического раствора. Каплю суспензии сенсибилизированных эритроцитов смешивают на предметном стекле бактериальной петлей с бактериальной массой стафилококков. За счет протеина «А» стафилококков происходит агглютинация эритроцитов, содержащих на своей поверхности JgG.

Выявление ДНК-азы. Нуклеаза выявляется у S. aureus, S. hyicus, S.intermedius.

Методика определения: к расплавленному и несколько охлажденному МПА добавляют раствор натриевой соли ДНК из

11

расчета 1–1,5 мг/мл и стерилизуют в водяной бане кипячением 30–40 минут. После охлаждения среды до 50–60°С к ней асептично добавляют хлорид кальция из расчета 0,8 мг/мл, разливают в чашки Петри по 10–15 мл.

На поверхность застывшей среды после ее подсушивания в термостате высеивают прикосновением петли в заранее размеченные точки 8–10 испытуемых культур стафилококка и инкубируют 18–20 ч при температуре 37°С. Затем в чашку вносят 4–5 мл 1н. раствора соляной кислоты, которую через 2-3 минуты сливают.

Результат реакции учитывают, просматривая чашки на проходящем рассеянном свете. По наличию просвечивающих зон вокруг колоний на непрозрачном, мутном серо-белом фоне всего слоя агара делают вывод – культура стафилококка продуцирует ДНК-азу.

Дифференциация патогенных стафилококков по отношению к манниту осуществляется на жидкой среде, содержащей 0,5% многоатомного спирта-маннита. Патогенные стафилококки маннит разрушают через 36 часов (среда изменяет цвет на желтый), непатогенные – значительно позже. Этот признак весьма неустойчив и самостоятельным показателем патогенности не является.

Дифференциация культур патогенных стафилококков на среде Чепмена. Среда имеет серовато-сиреневый цвет. Патогенные стафилококки дают на ней фиолетовые или оранжевые колонии, непатогенные – белые или сиреневые.

Таблица 2 – Свойства основных патогенных видов стафилококков

12

Исследование дополнительных ферментативных, культуральных и прочих свойств дает возможность идентифицировать другие виды стафилококка, достаточно часто выделяемые от животных (табл. 3).

Таблица 3 – Биохимические признаки и другие свойства стафилококков, выделяемых от животных

Обозначения:

«+» – 90% и более штаммов положительные; «–» – 90% и более штаммов отрицательные; d – 89%позитивные;

( ) – замедленная реакция; нд – нет данных;

Р– устойчивы;

Ч– чувствительны.

Фаготипирование стафилококков

Проводят для обнаружения источника возбудителя и установления эпизоотических (эпидемических) связей.

Фаготиповая принадлежность является маркером, позволяющим устанавливать идентичность штаммов, даже если другие характеристики подверглись изменениям. Для фаготипирования S. aureus существует международный набор фагов, включающий 21 фаготип, разделенный на 5 фагогрупп (I– V) Для типирования штаммов, выделенных от крупного рогатого скота, предложен свой набор фагов, состоящий из фаготипов 42 Д, 78, 102, 107, 117, 118, 119.

Техника фаготипирования: исследуемую культуру выращивают на скошенном МПА при 37–38°С в течение 18–24 часов, пересеивают в пробирку с 2,5 мл бульона Хоттингера, инкубируют при 37ºС 3–4 часа, засевают газоном в чашки Петри на 1,25%-ной МПА (рН 7,2–7,4) с 0,4% глюкозы и 0,02% кальция хлорида.

Засеянные чашки подсушивают 30–40 минут в термостате, расчерчивают дно чашки на 24 квадрата и стандартной бактериологической петлей (d=2 мм) в каждый квадратик вносят тот или иной фаг в рабочем титре. Бактериологическую петлю после каждой манипуляции прожигают. Посевы инкубируют 5-6 часов при 37ºС или 18–20 часов при 30ºС. Штаммы, не лизированные набором фагов, проверяют повторно, используя более концентрированный фаг ( 100).

14

Степень лизиса оценивают по следующей схеме: «++++» – полный лизис; «+++» – наличие в зоне лизиса колоний стафилококка;

«++» – в зоне капли фага обнаруживают более 50 колоний фага; «+» – от 20 до 50 колоний фага; «-» – полное отсутствие лизиса.

Во многих случаях культуры стафилококков лизируются не одним, а несколькими фагами, образуя своеобразную фагомозаику из стерильных пятен. Стафилококки, обнаруживающие одну и ту же мозаику или отличающиеся на 1 фаг, считаются идентичными.

3 Серологические исследования

В диагностике стафилококковых инфекций имеет вспомогательное значение, используясь, в основном, для диагностики хронических процессов (остеомиелит, септикопиемия и др.). Для определения антител к токсину стафилококка применяют РНГА с эритроцитарным диагностикумом, нагруженным α-токсином стафилококка или РН (реакция нейтрализации гемолитической активности стафилококкового токсина антитоксинами сыворотки крови больного в присутствии эритроцитов кролика).

Для выявления энтеротоксинов S. aureus в кормах и других субстратах применяют РДП (микровариант на предметных стеклах), радиоиммунологический анализ, РА, РЛА, ИФА, ПЦР, иммуноблоттинг.

4 Биологический метод исследования

Проводят для выявления патогенных свойств штаммов по летальному эффекту (биопроба на цыплятах), положительной дермонекротической реакции (некротоксин), а также на котятах для обнаружения способности продуцировать энтеротоксин. Известно шесть антигенно различных энтеротоксинов (А, В, С, В, E, F).

Дермонекротическая проба. У кролика альбиноса массой 2–2,5 кг за сутки до опыта на боку выстригают два участка размером 2×2 см. 24-часовую бульонную испытуемую культуру вводят внутрикожно в дозе 0,2 мл на обоих участках.

15