Материал: Лабораторная диагностика инфекционных болезней животных Методические указания к лабораторно-практическим занятиям для студентов факультета ветеринарной медицины и биотехнологии, направление подготовки 36.05.01 – Ветеринария

1)Поверхностные белки, капсульные и капсулоподобные полисахариды – адгезия.

2)Капсула – подавление фагоцитоза.

3)Белок А – подавление опсонической активности антител.

4)Ферменты: липаза – абсцедирование кожи; лецитиназа – лейкопения; коагулаза – подавление фагоцитоза; гиалуронидаза – инвазия; бетта-лактамазы – устойчивость к антибиотикам.

5)Токсины (экзотоксины): гемолизины – универсальные мембранотоксины; лейкоцидины – разрушение нейтрофилов, макрофагов; энтеротоксины А, В, С, Д – пищевая интоксикация; эксфолиатины А, В – разрушение межклеточных контактов; токсин СТШ (синдром токсического шока).

2 Микробиологические исследования и фаготипирование стафилококков

Микробиологические исследования

1)Определение родовой принадлежности

В1-й день исследования – петлей или шпателем материал засевают в чашки с 5% кровяным, а также желточноили молочно-солевым агаром, с 10% содержанием хлорида натрия (для посева экссудата, гноя из не вскрывшихся абсцессов, флегмон используют МПА или 5% кровяной агар), которые инкубируют 18–24 ч при 37°С и столько же на свету при комнатной температуре (для более четкого пигментирования колоний). Солевые среды ввиду высокого содержания хлорида натрия являются селективными для стафилококков, рост большинства сопутствующих микроорганизмов на них подавляется.

На 2-й день исследования – изучают выросшие колонии: стафилококки образуют выпуклые, ровные непрозрачные колонии средней величины белого, лимонно-желтого или золотистого цвета (гемолитические или негемолитические). Пигментообразование лучше заметно на молочно-солевом агаре. На желточно-солевом агаре большая часть патогенных стафилококков вызывает лецитиназную (лецитовителлазную) реакцию, проявляющуюся в образовании вокруг колонии зоны помутнения с радужным венчиком в отраженном свете.

6

S. aureus на плотных питательных средах формирует круглые, выпуклые, с гладкой, блестящей поверхностью непрозрачные колонии диаметром до 6–7 мм. Может образовывать α- и β- гемолизин. Цвет колонии серый, серо-белый с желто-оранжевым или оранжевым оттенком. Штаммы, выделенные от собак, обычно не пигментированы. Пигментообразование наиболее выражено на средах, содержащих кровь, сыворотку крови, молоко, углеводы. На жидких питательных средах растут с равномерным помутнением, образованием плотного, легко суспендируемого осадка.

S. hycus и S. intermedius на агаровых средах растут в виде круглых выпуклых, блестящих, непрозрачных колоний, достигающих на селективных средах диаметра 4–7 мм, пигмента не образуют.

S. gallinarum на плотных средах формирует непрозрачные, сухие, плоские, с дольчатыми краями колонии диаметром до 10– 15 мм, желтые или непигментированные. Некоторые штаммы на кровяном агаре дают слабый гемолиз.

S. caprae растет на агаровых средах в виде круглых, слабо выпуклых, непрозрачных, с блестящей поверхностью непигментированных колоний. На кровяном агаре замедленно, через 48 часов и более, образует узкую зону β-гемолиза с широкой зоной частичного обесцвечивания среды.

S.epidermidis на плотных средах образует круглые, с гладкой блестящей поверхностью, непрозрачные колонии диаметром 3–6

ммсерого или серо-белого цвета. При длительном культивировании липкость колонии возрастает и в центре формируется углубление. Некоторые штаммы образуют небольшое количество гемолизина. При росте на питательном бульоне формируется слизистый осадок.

S.saprophiticus растет на агаровых средах в виде круглых,

выпуклых, с гладкой, блестящей поверхностью колоний диаметром по 5–9 мм. Некоторые штаммы образуют желтый или желтооранжевый пигмент.

При микроскопии в мазках обнаруживают грамположительные кокки, расположенные гроздьями. Для выделения чистой культуры подозрительные колонии пересевают на скошенный МПА.

7

На 3-й день исследования – проверяют чистоту выделенной культуры, ставят тесты и делают посевы для ее идентификации на уровне рода.

Культуры из подозрительных колоний, после изучения морфологических и тинкториальных свойств клеток, отвивают на простой МПА, выращивают и исcледуют у них ряд признаков, позволяющих отличить стафилококки от сходных бактерий: виды родов Micrococcus, Enterococcus, Streptococcus. Исследуют способность к ферментации глюкозы в ОФ-тесте, наличие каталазы, оксидазы, коагулазы, чувствительность к бацитрацину (табл. 1).

Постановка OF-теста. Испытуемую культуру засевают уколом в столбик среды Хью – Лейфсона в двух пробирках, в одну из которых затем поверх среды наслаивают стерильное вазелиновое масло (0,5–1 мл). Посевы проводят иглой (или маленькой петлей), не доводя ее до дна пробирки на 5–6 мм, инкубируют при 37°С в течение 1–4 суток. Так как в среду в числе других компонентов входит агар в небольшой концентрации (что создает полужидкую консистенцию среды) и индикатор рН – бромтимоловый синий (придающий среде зеленовато-оливковый цвет), при учете реакции могут быть определены не только окисление или ферментация углевода (глюкозы), но также газообразование и подвижность.

8

Изменение цвета среды, в обеих пробирках на желтый, свидетельствует о расщеплении глюкозы ферментацией (F), изменение аналогичного характера только в открытой пробирке (не залитой вазелиновым маслом) – об окислительном процессе (О), а сохранение неизменного цвета в обеих пробирках – об отсутствии какого-либо метаболизма глюкозы (–).

Каталазный тест. Чистую культуру стафилококка вносят в каплю 3–10%-го раствора перекиси водорода на стекле и растирают круговыми движениями. При наличии каталазы перекись водорода разлагается с образованием пузырьков кислорода.

Определение коагулазы. Осуществляется путем посева культуры стафилококка в узкую пробирку с 0,5 мл 5% кроличьей или человеческой цитратной плазмы.

Посевы помещают в термостат на 6–10 часов с регистрацией результатов через 1, 2, 3 и 6 часов.

Наряду с классическим методом определения плазмокоагулазы, применяется также реакция плазмокоагуляции на стекле или ускоренный «слид-тест».

Этот методический прием основан на способности коагулазоактивных стафилококков склеиваться плазмой крови и коагулировать ее.

Коагулазоотрицательные штаммы таким свойством не обладают. Для выполнения реакции берут каплю воды, суспендируют в ней испытуемую культуру, после чего добавляют одну каплю разведенной согласно инструкции плазмы крови кролика или человека.

Через 15–60 секунд образуется плазменный сгусток. Более поздняя (позже минуты) реакция считается сомнительной, а реакция, наступившая через 3 минуты, – отрицательной.

Виды стафилококка коагулазоположительные: S. aureus, S. hyicus; коагулазоотрицательные: S. epidermidis, S. saprophyticus, S. haemolyticus, S. hominis.

Чувствительность к бацитрацину (0,04 ЕД/диск).

Стерильные бумажные диски пропитывают 0,04 ЕД бацитрацина. Испытуемую культуру засевают газоном на кровяной агар в чашках Петри и на поверхности среды помещают диск с бацитрацином. Посевы инкубируют 24 часа.

9

Положительный результат – стерильная зона вокруг диска. На 4-й день исследования – проводят окончательную

идентификацию культур по культурально-морфологическим, биохимическим тестам и др.

2) Определение видовых свойств стафилококков

Изучение патогенных свойств стафилококка позволяет отнести выделенную культуру к одному из трех основных патогенных видов (табл. 2).

Определение гемотоксина выполняется путем прямого посева культуры на кровяной МПА, содержащий 5-10% дефибринированной кроличьей или бараньей крови.

Альфа-гемолиз проявляется в виде полного просветления среды вокруг штриха культуры и нейтрализуется альфаантитоксической сывороткой.

Бета-гемолиз дает частичное просветление, зона которого имеет буровато-пурпурный оттенок. Это «тепло-холодовый» токсин и лучше выявляется после дополнительного суточного выдерживания чашек в холодильнике при температуре +4 °С.

Дельта-гемолиз определяется по узкой полоске гемолиза, не нейтрализуется альфа-антитоксической сывороткой.

Определение некротоксина производится путем внутрикожного введения кролику 0,2 мл взвеси 2 млрд., суточной агаровой культуры стафилококка в физиологическом растворе. Наблюдение за животным ведется в течение 24–48 часов. Как положительная реакция расценивается лишь инфильтрат с желтоватым центром, темным ободком и ярко-красной каймой по периферии с последующими явлениями некроза.

Определение фермента гиалуронидазы (фактор проникновения). Обнаружение этого фермента у стафилококка осуществляется в тесте декапсуляции. Берут штаммы капсулообразующих видов бактерий, имеющих в составе капсулы гиалуроновой кислоты: Streptococcus equi, Pasteurella multocida

(серовар А). На кровяной МПА в чашке Петри крестообразно засевают штрихом S. equi или P. multocida (серовар А) и под углом 90° аналогично в виде линии культуру испытуемого стафилококка. Посевы инкубируют при 37° С в течение 24 часов. При наличии гиалуронидазы колонии тест-микроба вблизи штриха

10