Статистический анализ полученных данных
Обработка статистических данных проводилась в программе WindowsMicrosoftExel2010. Полученные результаты обрабатывались методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. Подсчеты FG-положительных клеток проводились по конфокальным снимкам с помощью программы для пересчета клеток в конфокальных изображениях. Программа написана на языке Pythonс использованием программных библиотек Scikit-Image, Numpy, OpenCV2, Matplotlib.
Результаты и их обсуждение. Ретроградная маркировка ганглионарных клеток сетчатки. Изучение ГКС, которые поражаются при глаукоме, возможно только после их специфической идентификации. Одним из основных методов для визуализации большинства ГКС является их отслеживание с помощью введения красителя в структуры, где заканчиваются аксоны этих клеток, а именно: superiorcolliculiсреднего мозга [16, 23, 24]. Для этих целей мы выполняли стереотаксические инъекции с использованием специфического ретроградного красителя FG. Он активно захватывается терминалями соответствующих аксонов и транспортируется к соме клеток, где и аккумулируется. После этого с помощью флуоресцентной микроскопии можно четко идентифицировать популяцию ГКС. Такая идентификация является высокоспецифичной [4, 14, 15, 26, 30].
При проведении анализа конфокальных снимков коронарных срезов головного мозга крыс был установлен флуоресцентный ответ, соответствующий участку красителя FG, что дает основание для дальнейшей идентификации ГКС.
Влияние поляризованного света на ГКС
Для оценки влияния поляризованного света на ГКС использовали группу животных (n=6), которым было проведено ретроградное мечение путем введения FGв superiorcolliculiкаждой гемисферы. На третьи сутки каждое животное получало терапию поляризованным светом с зеленым фильтром при помощи аппарата «Биоптрон». Левый глаз экранировался, а на правый глаз проводилась экспозиция света в течение 3 мин с расстояния 30 см. После 10 сеансов терапии животные выводились из эксперимента, проводился подсчет количества FG-положительных клеток и статистическая обработка результатов. Подсчеты FG-положительных клеток проводились с помощью программы для перечисления клеток в конфокальных изображениях (рис. 2).
Рис. 1. Визуализация красителя Fluorogoldв superiorcolliculiсреднего мозга
Рис. 2. Визуализация ретроградно маркированных ганглионарных клеток сетчатки при экспериментальной глаукоменизкого давления у крыс
Рис. 3. Подсчет Бв-положительных клеток по конфокальным снимкам с помощью программы для исчисления клетокв конфокальных изображениях
Каждое конфокальное изображение обрабатывалось по следующему алгоритму: пространственная низкочастотная фильтрация для устранения низкочастотных градиентов; пространственная высокочастотная фильтрация для устранения пространственных шумов; перевод изображения в черно-белое представление; удаление слишком больших или слишком маленьких пятен сегментации изображения и подсчет клеток (рис. 3).
Рис. 4. Количество идентифицированных ганглионарных клеток сетчатки в контроле, при воздействии зеленого поляризованного света, при глаукоме и при воздействии зеленого поляризованного света на сетчатку с экспериментальной глаукомой
Сравнение количества ГКС левого и правого глаза не выявило достоверной разницы между этими двумя группами, хотя наблюдалась положительная тенденция увеличения ГКС под влиянием терапии поляризованным зеленым светом (рис. 4). Среднее значение количества клеток в контрольных образцах сетчатки, полученных от крыс с глаукомой низкого давления, было 567.0±42.2, в то время как среднее значение количества клеток в сетчатке, подлежащей воздействию поляризованного света, было 646.3±29.3 (р=0.269). Результаты данного эксперимента показывают, что выбранные протоколы воздействия поляризованного зеленого света на здоровый глаз не являются токсичными и вредными и могут быть использованы в дальнейшем исследовании лечения экспериментальной глаукомы у крыс.
В работах Каги Т. I. и соавторов [9, 10] высказывается гипотеза о том, что цитохромоксидаза - фермент, который катализирует перенос электронов с цитохромаСна молекулы кислорода на финальном этапе дыхательной цепи внутри митохондрий - выполняет роль первичного фоторецептора. В дальнейшем эта гипотеза продолжала изучаться и неоднократно подтверждалась [8, 9, 29]. Группа ученых из Медицинского колледжа Висконсина [3] в своем исследовании продемонстрировала, что светодиодная фотостимуляция глаза индуцирует каскад сигнальных событий, инициированных начальным поглощением света цитохромоксидазой. Эти сигнальные события могут включать активацию ближайших ранних генов, факторов транскрипции, экспрессии гена субъединицы цитохромоксидазы и многих других ферментов и путей, связанных с повышенным окислительным метаболизмом [11, 28, 31]. Кроме увеличения окислительного метаболизма, как известно, стимуляция микрохондриального электронного переноса способствует увеличению образования активных форм кислорода [11]. Эти митохондриально образованные реактивные виды кислорода могут функционировать как сигнальные молекулы для обеспечения связи между митохондриями, цитозолем и ядром, и таким образом играют важную сигнальную роль в активации ретинопротекторных процессов после влияния света, что подтверждалось улучшением зрения [31].
Стимуляция цитохромоксидазы с помощью света может приводить к повышению энергетического обмена в митохондриях, повышению уровня метаболизма внутри клетки, активировать пролиферацию и миграцию клеток [5, 18]. Таким образом в данном случае положительная тенденция к увеличению ганглионарных клеток в сетчатке может быть следствием стимуляции цитохромоксидазы поляризованным светом.
Развитие глаукомы низкого давления и влияние на ГКС у крыс
На третьи сутки после проведения ретроградного окрашивания ГКС в группе крыс (п=7) было выполнено травматическое повреждение зрительного нерва на 1 мм от глазного яблока на обоих глазах. Через 24 часа после вмешательства каждое животное получало терапию поляризованным светом с зеленым фильтром. Левый глаз экранировался, а на правый глаз проводилась экспозиция света в течение 3 мин с расстояния 30 см. После 10 сеансов терапии животные выводились из эксперимента и проводился подсчет количества БО-положительных клеток и статистическая обработка результатов.
Обработка результатов проводилась как описано выше и продемонстрировала существенное достоверное уменьшение количества ганглионарных клеток при экспериментальной глаукоме в соответствии с контролем. Среднее значение количества клеток в сетчатках, полученных от крыс с глаукомой низкого давления, было 235.2±29.9, в то время как среднее значение количества клеток в контрольных сетчатках было 567.0±42.22 (р<0.0003).
Повреждения оптического нерва - одна из классических методик изучения механизмов развития глаукомы, а именно - гибели ГКС и потери зрения [26]. За развитием данного состояния стоят различные механизмы. Учитывая тот факт, что глаза - это имму-нокомпетентный орган, защищенный от воздействия периферических иммунных клеток, можно предположить, что в результате травмы происходит активация микроглии сетчатки, астроцитов и клеток Мюллера, которые синтезируют различные провоспалительные медиаторы (глутамат^-серин, нитрит азота, фактор некроза опухолей), в результате чего и происходит повреждение ГКС [6, 17, 20]. Также при развитии глаукомы описана дисфункция митохондрий [22], в результате этого нарушается окислительное фосфорилирование и обмен энергии в клетке с накоплением реактивных соединений кислорода, нарушается работа цитохрома С, активируются проапоптотиче-ские медиаторы и, наконец, запускаются механизмы апоптоза, в результате чего происходит гибель клеток сетчатки.
Влияние поляризованного света ГКС при глаукоме. Анализ действия поляризованного света на ГКС в модели глаукомы низкого давления у крыс не показал существенных различий, хотя наблюдалась тенденция уменьшения ГКС под влиянием терапии поляризованным зеленым светом. Среднее значение количества клеток в сетчатке, полученных от крыс с глаукомой низкого давления, было 235.2±29.9. В то же время среднее значение количества клеток в сетчатке крыс с глаукомой, которые подвергались воздействию поляризованного света, было 185.8± 18.5 (р=0.096).
По данным КаЫжукаи С. [7], после проведения повреждения оптического нерва происходят значительные изменения в морфологии ГКС, а именно: снижение флуоресцентного сигнала от ГКС, а также оставшиеся уменьшения длины дендритов и степени их разветвления по сравнению с контролем. На 9 сутки после повреждения оптического нерва почти все аксоны отсутствовали или имели дегенеративные изменения, и оставалось примерно 36 % ганглионарных клеток по сравнению с контролем.
Сопоставляя данные литературы и результаты наших исследований, следует отметить, что получен очень похожий результат - 34 %-е уменьшение количества ГКС при глаукоме по сравнению с контрольными образцами сетчатки.
Кроме того, другие исследователи [3] сообщают о положительном влиянии красного и инфракрасного света на восстановление клеток сетчатки после травмы зрительного нерва.
Результаты проведенного экспериментального исследования показали перспективность дальнейших исследований в направлении изучения влияния поляризованного света при глаукоме нормального давления в клинике. Однако протокол терапии по времени и дозе применяемого лечения требует дальнейшего усовершенствования при экстраполяции в клинических условиях.
Выводы
Предложена новая модель экспериментальной глаукомы низкого давления. Установлена тенденция влияния поляризованного света на ГКС при экспериментальной глаукоме. Биологическое действие энергии света реализуется путем фотохимической трансформации в митохондриях через взаимодействие цитохромоксидазы и влияет на энергетические процессы внутри клетки, на обезвреживание реактивных соединений кислорода, пролиферацию, миграцию клеток. В целом это позволяет в дальнейшем изучать свойства влияния света на биологические процессы внутри клеток и рассматривать его как перспективное направление в развитии альтернативной терапии заболеваний сетчатки.
Литература
1. Barron K.D. Qualitative and quantitative ultrastructural observations on retinal ganglion cell layer of rat after intraorbital optic nerve crush / K. D. Barron, M.P. Dentinger, G. Krohel[et al.] // J Neurocytol. - 1986. - Vol. 15. - P. 345-362.
2. Bueno J.Polarization and retinal image quality estimates in the human eye / J. Bueno // Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. - 2001. - Vol. 18 (3). - P. 489-496.
3. Eells J. T. Therapeutic photobiomodulation for methanol-induced retinal toxicity / J. T Eells, M. M. Henry, P. Summerfelt[et al.] // Proc Natl AcadSci USA. - 2003. - Vol. 100 (6). - P. 3439-3444.
4. Fisher J. Vaccination for neuroprotection in the mouse optic nerve: implications for optic neuropathies / J. Fisher // J Neurosci. - 2001. - Vol. 21. - P. 136-142.
5. Hamblin M. R. Mechanisms of low level light therapy / M. R. Hamblin, T N. Demidova // Proc of Spie. 2006. - Vol. 6140 (6). - P. 1-12.
6. Inman D. M. Reactive nonproliferative gliosis predominates in a chronic model of glaucoma / D. M. Inman, P. J. Horner // Glia. - 2007. - Vol. 55. - P. 942-953. - DOI: 10.1002/glia.20516.
7. Kalesnykas G. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma / G. Kalesnykas, E. N. Oglesby, D. J. Zack [et al.] // Investigative Ophthalmology & Visual Science. - 2012. - Vol. 53 (7). - P. 3847-3857. - DOI: 10.1167/ iovs.12-9712.
8. KaruT. I. A novel mitochondrial signaling pathway activated by visible-to-near infrared radiation / T I. Karu, L. V. Pyatibrat, N. I. Afanasyeva // PhotochemPhotobiol. - 2004. - Vol. 80 (2). - P. 366-372.
9. KaruT. I. Absorption measurements of a cell monolayer relevant to phototherapy: reduction of cytochrome oxidase under near IR radiation / T. I. Karu, L. V. Pyatibrat, S. F. Kolyakov, N. I. Afanasyeva // J PhotochemPhotobiol B. - 2005. - Vol. 81 (2). - P. 98-106.
10. KaruT. I. Photobiology of Low-Power Laser Therapy / T. I. Karu // United Kingdom: The Universities Press (Belfast) Ltd. - 1989.
11. KaruT. J. Primary and Secondary mechanisms of action on visible to near-IR Radiation on cells / T. J. Karu // PhotochemPhotobiol. - 1999. - Vol. 49. - P. 1-17.
12. LeveneR. Z. Low tension glaucoma: a critical review and new material / R. Z. Levene // SurvOphthalmol.1980. - Vol. 24 (6). - P. 621-664.
13. Levine R. Z. Low-tension glaucoma: A critical review and new material / R. Z. Levine // SurvOphthalmol.
- 1980. - Vol. 24. - P. 621-663.
14. Levkovitch-VerbinH.RGC death in mice after optic nerve crush injury: oxidative stress and neuroprotection / H. Levkovitch-Verbin // Investigative ophthalmology & visual science. - 2000. - Vol. 41. - P. 4169-4174.
15. Li Y.VEGF-B inhibits apoptosis via VEGFR-1-me- diated suppression of the expression of BH3-only protein genes in mice and rats / Y. Li // The Journal of clinical investigation. - 2008. - Vol. 118. - P. 913-923.
16. Linden R. Massive retinotectal projection in rats / R. Linden, V. H. Perry // Brain Res. - 1983. - Vol. 272. - P. 145-149.
17. Liu S. Tracking retinal microgliosis in models of retinal ganglion cell damage / S. Liu, Z. W. Li, R. N. Weinreb[et al.] // Invest Ophthalmol Vis Sci. - 2012.
- Vol. 53. - P. 6254-6262. - DOI: 10.1167/iovs.12- 9450.
18. Lovschall H. Low level laser therapy effect on mitochondrial rodamine 123 uptake in human oral fibroblasts in vitro / H. Lovschall, D. Arenholt-Bindslev // Lasers Life Sci. - 1998. - Vol. 8. - P. 101-116.
19. Paxinos G. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates /
G. Paxinos. - Sydney: Academic Press. - 2008. - 400 p.
20. Perez V. L. The eye: a window to the soul of the immune system / V. L. Perez, A. M. Saed, Y. Tan [et al.] // J Autoimmun. - 2013. - Vol. 45. - P. 7-14. - DOI: 10.1016/jjaut.2013.06.011.
21. Quigley H. A. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020 / H. A. Quigley, A. T. Broman // BrJ Ophthalmol. - 2006. - Vol. 90. - P. 262-267.
22. Sadun A. A. Mitochondrial optic neuropathies / A. A. Sadun // J NeurolNeurosurg Psychiatry. - 2002. - Vol. 72. - P. 423-425.
23. Salinas-Navarro M. A computerized analysis of the entire retinal ganglion cell population and its spatial distribution in adult rats / M. Salinas-Navarro, S. Mayor-Torroglosa, M. Jimenez-Lopez [et al.] // Vis. Res. - 2009. - Vol. 49. - P. 115-126.
24. Salinas-Navarro M. Retinal ganglion cell population in adult albino and pigmented mice: a computerized analysis of the entire population and its spatial distribution / M. Salinas-Navarro, M. Jimenez-Lopez, F. J. Valiente-Soriano [et al.] // Vis. Res. - 2009. - Vol. 49. - P. 637-647.
25. Sommer A. Relationship between intraocular pressure and primary open angle glaucoma among white and black Americans. The Baltimore Eye Survey / A. Sommer, J. M. Tielsch, J. Katz [et al.] // Arch Ophthalmol. - 1991. - Vol. 109. - P. 1090-1095.
26. Tang Z. Survival effect of PDGF-CC rescues neurons from apoptosis in both brain and retina by regulating GSK3beta phosphorylation / Z. Tang // The Journal of experimental medicine. - 2010. - Vol. 207. - P. 867-880.