Количественный анализ витальности ганглионарных клеток сетчатки при экспериментальной глаукоме низкого давления у крыс: эффект терапии поляризованным светом
Н.В. Войтенко 1, С.А. Рыков2, И.В. Шаргородская2, К.С. Агашков1, М.Е. Краснякова1, Н.С. Николайчук3, О.А. Рыбачук1, Е.Ю. Забенько1, А.В. Дромарецкий1 Институт физиологии имени А. А. Богомольца НАН Украины
г. Киев, Украина, Национальная медицинская академия последипломного образования имени П. Л. Шупика МЗ Украины г. Киев, Украина, Киевская городская клиническая офтальмологическая больница
«Центр микрохирургии глаза» МЗ Украины- г. Киев, Украина
Цель работы. Глаукома низкого давления (норматензивная глаукома) (ГНД) - это прогрессирующая нейропатия зрительного нерва без повышения внутриглазного давления, характеризующаяся сужением полей, снижением остроты зрения или развитием полной слепоты с атрофией дисков зрительно нерва. Целью данной работы было изучение витальностиганглионарных клеток сетчатки, которые поражаются при глаукоме, после их специфической идентификации.
Материалы и методы. Ганглионарные клетки сетчатки (ГКС) идентифицировались введением флуоресцентного красителя Fluorogoldв структуры, где заканчиваются аксоны этих клеток, а именно: superiorcolliculiсреднего мозга. Экспериментальную глаукому низкого давления у крыс индуцировали путем повреждения зрительных нервов.
Результаты и их обсуждение. Предложена новая модель экспериментальной глаукомы низ- кого давления. Показано, что по сравнению с контрольными животными у крыс с экспериментальной глаукомой существенно уменьшается количество ганглионарных клеток сетчатки. Анализ действия поляризованного света на ГКС в модели экспериментальной глаукомы у крыс выявил тенденцию к изменению количества ГКС в отличие от контроля.
Ключевые слова: глаукома низкого давления, ганглионарные клетки сетчатки, зрительный нерв, поляризованный зеленый свет, флуоресцентный краситель.
КІЛЬКІСНИЙ АНАЛІЗ ВІТАЛЬНОСТІ ГАНГЛІОНАРНИХ КЛІТИН СІТКІВКИ ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІЙ ГЛАУКОМІ НИЗЬКОГО ТИСКУ У ЩУРІВ: ЕФЕКТ ТЕРАПІЇ ПОЛЯРИЗОВАНИМ СВІТЛОМ
Н.В. Войтенко, С.О. Риков, І.В. Шаргородська, К.С. Агашков, М.Є. Краснякова, Н С. Ніколайчук, О.А. Рибачук, Є.Ю. Забенько, А.В. Дромарецький
Глаукома - захворювання, що характеризується зниженням гостроти зору, звуженням поля зору через пошкодження гангліонарних клітин сітківки під впливом підвищеного внутрішньоочного тиску. Вивчення ган- гліонарних клітин сітківки, які уражаються при глаукомі, можливе лише після їхньої специфічної ідентифікації. У даній роботі гангліонарні клітини сітківки ідентифікувалися введенням флуоресцентного барвника Fluorogoldу структури, де закінчуються аксони цих клітин, а саме - в superiorcolliculiсереднього мозку. Експериментальну глаукому низького тиску у щурів індукували шляхом пошкодження зорових нервів. Було виявлено, що у щурів з експериментальною глаукомою істотно зменшується кількість гангліонарних клітин сітківки (ГКС) у порівнянні з контрольними тваринами. Аналіз дії поляризованого світла в моделі експериментальної глаукоми низького тиску у щурів виявив тенденцію до зміни кількості ГКС на відміну від контролю.
Ключові слова: глаукома низького тиску, гангліонарні клітини сітківки, зоровий нерв, поляризоване зелене світло, флуоресцентний барвник.
QUANTITATIVE ANALYSIS OF VITALITY OF RETINAL GANGLION CELLS IN EXPERIMENTAL LOW-PRESSURE GLAUCOMA IN RATS: THE EFFECT OF POLARIZED LIGHT THERAPY
N.. Voitenko1, S.O. Rykov2,I. V. Shargorodska2, K.S. Agashkov1, M.E. Krasniakova1, N.S. Nikolaichuk3, O A. Rybachuk1, E.Y. Zabenko1, A. V. Dromaretsky1 1 Institute of Physiology named after O.O. Bogomoletz of NASU Kyiv, Ukraine, National Medical Academy of Postgraduate Education named after P. L. Shupyk of the Ministry of Public Health of Ukraine
Aim. Glaucoma is a disease characterized by a decrease in visual acuity, narrowing of the visual fields due to damage of retinal ganglion cells under the influence of increased intraocular pressure. Low-pressure glaucoma (normoten- sive glaucoma) is a progressive neuropathy of the optic nerve without an increase in intraocular pressure, characterized by narrowing of the fields, decreased visual acuity, or development of complete blindness with an atrophy of optic nerve discs. The aim of this study was to analyze the vitality of retinal ganglion cells, which are affected by glaucoma, after their specific identification.
Materials and methods. In this study, retinal ganglion cells were identified by the injection of the fluorescent dye Fluorogold into the structures where the axons of these cells terminate, namely, the superior colliculi of the midbrain. Experimental low-pressure glaucoma in rats was induced by damage to the optic nerves.
Results and discussion. Here, we shown that in rats with experimental glaucoma the amount of ganglion cells in the retina is significantly reduced in comparison with control animals. The analysis of the effect of polarized light on ganglionic cells of the retina in the model of experimental glaucoma in rats did not reveal any significant differences from the control.
Key words: low-pressure glaucoma, retinal ganglion cells, optic nerve, polarized green light, fluorescent dye.
глаукома низкого давления поляризованный свет
Перспективы дальнейшего поиска методов ранней субклинической диагностики глаукомы, которые помогли бы объяснить механизмы развития, выявления склонности к прогрессированию, оптимизировать методы лечения и определять результативность проводимой терапии этого патологического процесса, приводящего к глубокой инвалидизации и слепоте, с каждым годом становятся все актуальнее. Глаукома, как известно, - заболевание, характеризующееся снижением остроты зрения, изменениями головки зрительного нерва, увеличением экскавации диска зрительного нерва, что соответствует повреждению ганглионарных клеток сетчатки (ГКС) и обуславливает характерные нарушения в поле зрения под влиянием повышенного внутриглазного давления. Это - тяжелое, прогрессирующее заболевание и является первой в мире причиной необратимой слепоты [21].
Исторически сложилось так, что глаукома считается болезнью высокого внутриглазного давления. Однако в последнее время коренным образом изменились представления о патогенезе этого заболевания. Установлена возможность развития глаукомы при нормальном уровне внутриглазного давления. Глаукома низкого давления (норматензивная глаукома) - это прогрессирующая нейропатия зрительного нерва без повышения внутриглазного давления, характеризующаяся характерными изменениями диска зрительного нерва и сужением поля и остроты зрения вплоть до развития полной слепоты с атрофией дисков зрительно нерва. TheBaltimoreEyeSurveyсообщает, что примерно половина всех пациентов с диагнозом первичной открытоугольной глаукомы имеет внутриглазное давление ниже 21 мм рт. ст. [25, 27]. Патологическая картина известна как глаукома нормального давления (ГНД), сам термин появился в научной медицинской литературе в ХХ веке [13] и продолжает фигурировать и на современном этапе. Статистически глаукома нормального давления составляет от 30 % до 40 % от всех пациентов с характерными для глаукомы дефектами полей зрения [27]. Согласно данным литературы [12], в европейских странах глаукома низкого давления составляет 20 % - 30 % от всех случаев глаукомы, а в Японии ГНД страдают 2 % населения, и у лиц в возрасте после 40 лет число случаев ГНД в 4 раза превышает число случаев глаукомы с высоким давлением.
Эволюционно зрительная система возникла благодаря существованию электромагнитных волн оптического диапазона. Одним из его биотропных параметров является поляризованный свет. Свет называется поляризованным, если взаимно перпендикулярные векторы напряжения электрического и магнитного полей колеблются с постоянной во времени разностью фаз. Оно возникает при рассеянии солнечного света в пределах атмосферы и гидросферы, а также при отражении света от водных поверхностей, грунта, горных пород, растительности. Пайлер-свет - это линейный поляризованный некогерентный полихро- магический свет с длиной волны 400-2000 нм.
Исследования и поиск новых методов лечения глаукомы нормального давления являются актуальным вопросом, ведь ранняя диагностика и скрининг этого заболевания крайне сложны. Необходим поиск новых методов лечения, так как несвоевременное и неэффективное лечение может иметь значительные негативные последствия для индивидуального и общественного здоровья. Для повышения эффективности лечения больных глаукомой низкого давления актуальным является изучение влияния пайлер-света.
Пайлер-терапия - лечебное применение поляризованного полихроматического некогерентного с низкой интенсивностью излучения света видимого и инфракрасного спектра. Начало современной свето- терапии положил датский врач Нильс РибергФинзенболее 100 лет назад. В 1903 году он был награжден Нобелевской премией (медицина) за достижения в лечении светом. Финзен создал первый аппарат, который генерировал свет, подобно солнечному, и получил выдающиеся результаты в лечении пациентов, страдающих волчанкой.
По данным BuenoJ.[2], рецепторы сетчатки реагируют на поляризованный свет, в зрительной коре возникают вызванные потенциалы в ответ на стимуляцию сетчатки глаза поляризованным светом. Неизученным остается влияние поляризованного света при глаукоме нормального давления.
Материалы и методы. В опыт включены взрослые крысы линии Wistar, самцы массой тела 250300 г. Для анестезии использовали ксилазин 10 мг/кг (Биовет-Пулави, Польша) и кетамин 60 мг/кг массы тела (Фармак, Украина). Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с нормами Комитета по биоэтике животных Института физиологии имени А. А. Богомольца и Национальной медицинской академии последипломного образования имени П. Л. Шупика (Киев, Украина) и соответствуют директивам европейской комиссии (86/609/EEC). Были приложены все усилия для уменьшения страдания животных и для того, чтобы минимизировать их ко - личество. При проведении всех манипуляций соблюдались условия асептики и антисептики.
Ретроградная маркировка ганглионарных клеток сетчатки
Одним из основных методов для визуализации ГКС является проведение стереотаксических инъекций при использовании ретроградного красителя Fluorogold2 % (FG, Termofisherscientific) [16, 23, 24] с последующей идентификацией с помощью флуоресцентной микроскопии [4, 13, 15, 26, 30]. Стереотаксические инъекции проводились с использованием следующего оборудования: стандартная рамка для стереотаксиса, держатель для головы крысы, индивидуально выполненный держатель для шприца, пинцет, микроножницы, иглодержатель и шприц Гамильтон (Hamilton). В ходе операции крысы были анестезированы интраперитонеально смесью кетамина и ксилазина, животные проверялись на наличие арефлексии к болевому стимулу. Кожа в теменной области была очищена от шерсти, и животное было закреплено в рамку стереотаксиса. Защитные глазные капли закапывались в каждый глаз для предотвращения пересыхания в течение операции. Затылочный участок был обработан 70 % спиртом и раствором повидон-йода. Кожа рассекалась продольно в проекции сагиттального шва, что позволяет визуализировать структуры черепа и соответствующие ориентиры (сагиттальный шов, брегма, лямбдовидный шов, затылочный шов). Рана обрабатывалась салфеткой, смоченной в 3 %-ом растворе перекиси водорода. После идентификации брегмыsuperiorcolliculus (SC) - верхний, или зрительный, бугорок четверохолмия - определялся согласно атласу [19] по координатам: -6.5mmAP; 1.2mmML; 3.5mmDVс каждой стороны гемисфер. Трепанационные отверстия черепа делались с обеих сторон в соответствии с этими координатами. С помощью микровинта и шприца Гамильтон выполнялась инъекция FGв объеме 200 nLв superiorcolliculusв каждую гемисферу. Далее накладывались швы на рану, и кожа обрабатывалась раствором повидон-йода. После операции животных перемещали в сухую подогретую клетку и наблюдали за ними до восстановления их функций, после чего транспортировали в виварий. Краситель FGактивно захватывается терминалями соответствующих аксонов, имеющих свойство синаптичес-ки переключаться в superiorcolliculus, и транспортируется к соме клеток с помощью микровезикул, где и аккумулируются. На третьи сутки большинство ГКС становится FGположительными и могут быть использованы для дальнейшего исследования.
Индукция экспериментальной глаукомы низкого давления
Экспериментальная глаукома у крыс индуцировалась повреждением зрительных нервов [32]. Операция повреждения зрительного нерва проводилась на третьи сутки после инъекции 2 % раствора FG. Крысы анестезировались интраперитонеально смесью кетамина и ксилазина и проверялись на наличие арефлексии к болевому стимулу. Защитные глазные капли (Natriumhyaluronate) инсталлировались в каждый глаз для предотвращения пересыхания глаз в течение операции. Животные фиксировались под бинокулярным микроскопом, и латеральная канто- томия проводилась для доступа к заднему полюсу глазного яблока. Бульбарная конъюнктива в верхнем темпоральном участке осторожно фиксировалась микропинцетом и под углом 90° рассекалась микроножницами. Мягкие ткани осторожно разводились для предотвращения травмы сосудов и мышц. Зрительный нерв выделялся на расстоянии примерно 1 мм от заднего полюса глазного яблока, после чего на него накладывался самозажимающийся пинцет DumontNo. 5 на 3 секунды. На конъюнктиву и на латеральный угол глаза накладывались швы. Повреждение зрительного нерва проводилось на обоих глазах. После операции животных перемещали в сухую подогретую клетку и наблюдали за ними до восстановления их функций, после чего транспортировали в виварий.
Аппликация поляризованного света
На 1 сутки после проведения повреждения зрительного нерва и в течение следующих 10 дней ежедневно в одинаковое время использовали поляризованный свет с зеленым фильтром аппарата «Биоптрон» для изучения его действия при данных условиях. Животные фиксировались, левый глаз экранировался, и с расстояния 30 см в течение 3 минут проводилась терапия только правого глаза. Опыты проходили в затемненной комнате при отсутствии воздействия прямого естественного и искусственного освещения, после чего животные возвращались в виварий.
Морфологические исследования
Через сутки после последнего сеанса в 10-дневном курсе животные были исключены из эксперимента путем эвтаназии с использованием диэтилового эфира и дислокации шейного отдела спинного мозга. Глаза были энуклеированы и перемещены в камеру с раствором Ринге-ра, который состоял (в миллимоллях): NaCl 115, KCl3, CaCl22, MgCl2 1, NaH2PO4 1, NaHCO3 25, глюкоза 11, раствор был насыщен смесью 95 % О2 и 5 % СО2. В этом растворе сетчатка с каждого глаза отпрепариро-вывалась и делались декомпрессионные разрезы, после чего они сразу фиксировались охлажденным раствором 4 % параформальдегида в течение 1 часа. В дальнейшем ткань сетчатки отмывали охлажденным раствором 0.1 м фосфатного буфера и фиксировали стеклом в специальной среде для флуоресцентных препаратов (Sigma, США). Оптические исследования проводили с помощью конфокального микроскопа FluoView™ FV1000 (OlympusInc., Япония) с цифровой фотокамерой, совмещенной с компьютером. Количество FG-положительных клеток в ткани сетчатки в норме и после моделирования глаукомы подсчитывали в пределах прямоугольной зоны фиксированного размера - 0,4 мм2. Подсчеты FG-положительных клеток проводились по конфокальным снимкам с помощью программы для исчисления клеток в конфокальных изображениях. Для проведения исследования была разработана специальная программа на языке Pythonс использованием программных библиотек Scikit-Image, Numpy, OpenCV2, Matplotlib.
Сразу после проведения энуклеации проводилась трепанация черепа и удаление головного мозга крысы, который сразу фиксировали охлажденным раствором 4 % параформальдегида в течение 1 часа. В дальнейшем ткань головного мозга отмывали охлажденным раствором 0,1 мл фосфатного буфера. Через некоторое время с помощью вибратома(Cempdel, Великобритания) делали коронарные срезы головного мозга толщиной 200 рМ, и соответственно методике, описанной выше, проводилась оценка и качество проведения стереотаксических инъекций.