Амплитуда осцилляторного ритма в ответ на запах цинеола (5%) у улиток, обученных пищевой реакции на цинеол, достоверно (р < 0,001) уменьшалась на 11% уже в первые 10 с после подачи запаха. В интервал 11-20 с после подачи запаха амплитуда осцилляций процеребрума уже возвращалась к исходным значениям и далее существенно не менялась. Вместе с изменениями амплитуды осцилляций изменялась и их частота, т.е. в тот же временной интервал. Достоверное урежение осцилляций на 41% наблюдали в интервале 1-10 с после подачи цинеола в концентрации 5%. В другие временные периоды не наблюдали достоверного изменения частоты осцилляций. Таким образом, изменения амплитуды (уменьшение) и частоты (урежение) осцилляций фокального потенциала в процеребруме улиток, обученных пищевой реакции на цинеол, в ответ на адекватную стимуляцию происходят синхронно (в один промежуток времени).
Появление реакции процеребрума в ответ на предъявление цинеола (5%) во временном интервале 1-10 с является существенным отличием таких улиток от наивных улиток и улиток, обученных аверсивной реакции на цинеол, у которых реакция на воздействие запаха цинеола (в концентрации 5%) проявляется позже.
Изменения амплитуды осцилляций процеребрума у улиток, обученных пищевой реакции на цинеол, в ответ на предъявление цинеола в концентрации 20% были более длительными. Максимальное достоверное (р < 0,001) снижение амплитуды осцилляций на 11% наблюдали в первые 10 с после подачи цинеола на препарат. Амплитуда осцилляций возвращалась в норму только через 30 с после аппликации цинеола. Максимальное и достоверное учащение осцилляций процеребрума отмечено только через 20 с после начала подачи цинеола на препарат. В этот интервал (21-30 с) частота осцилляций увеличилась на 30%.
У улиток, обученных пищевой реакции, изменения обонятельного ритма процеребрума происходят в зависимости от концентрации цинеола, и характер реакции принципиально отличается от ответов улиток, обученных аверсивной реакции на цинеол и наивных улиток. Исходя из этого можно предположить, что отличия осцилляций у обученных пищевой или аверсивной реакции животных могут быть связаны с запуском разного поведения. Возможно, что десинхронизация активности нейронов (т. е. уменьшение амплитуды осцилляций) процеребрума не связана с дискриминацией (определением значимости) запаха, а только с его восприятием и, возможно, силой (концентрация запаха) и длительностью воздействия сенсорной информации. В то же время синхронизация и увеличение частоты осцилляций коррелирует с распознаванием качества обонятельного стимула и поиском пищи.
Вызванная запахом активность в нейронах ЦНС улитки.
Активность идентифицируемых нейронов, участвующих в реализации пищевого или оборонительного поведения улитки также изменялась при аппликации цинеола на препарат и зависела от концентрации запаха. Например, реакция мотонейрона щупальца МтЦ3 (третий метацеребральный нейрон) всегда имела дозозависимый характер ответа на аппликацию цинеола у всех групп улиток. Однако, у улиток, обученных оборонительной реакции на цинеол, реакция мотонейрона МтЦ3 на запах имела очень сильно выраженный характер (длительная пачечная активность) вне зависимости от концентрации запаха цинеола. Такой ответ прямо соответствует достоверным изменениям амплитуды и частоты спонтанных осцилляций процеребрума у тех же улиток вне зависимости от концентрации запаха.
На полуинтактном препарате наивной улитки было отмечено появление спайковой активности в нейроне МтЦ1 (модуляторный нейрон пищевого поведения) в ответ на предъявление цинеола в большой концентрации (20%), которая также отражается в церебро-буккальной коннективе. Увеличение спайковой активности в нейроне МтЦ1 и церебро-буккальной коннективе наблюдали только в ответ на аппликацию цинеола в большой концентрации, в то время как при аппликации 5%-ного цинеола выраженных изменений в активности МтЦ1 у наивных улиток in vitro не отмечено.
У улиток, обученных оборонительной реакции на цинеол, не отмечена спайковая активность ни в модуляторном нейроне пищевого поведения, ни в командном нейроне оборонительного поведения (Пл1, первый плевральный нейрон) в ответ на предъявление цинеола (5%, 20%).
У улиток, обученных пищевой реакции на цинеол, наблюдали появление спайковой активности в МтЦ1 нейроне через 20 с после нанесения запаха (20%) на препарат, что может свидетельствовать о пищевом поведении в ответ на предъявление цинеола в большой концентрации (20%). Такую же активность нейрона МтЦ1 в ответ на запах цинеола наблюдали и у наивных улиток.
Соотнесение осцилляций в процеребруме с активностью идентифицированных нейронов пищевого и оборонительного поведения.
В электрофизиологических экспериментах на полуинтактном препарате (ЦНС--ольфакторный нерв--щупальце с обонятельным эпителием) проводили синхронную экстраклеточную регистрацию от апикальной части (клеточный слой) процеребрума и внутриклеточную электрофизиологическую регистрацию от нейронов ЦНС, вовлеченных в реализацию оборонительного и пищевого поведения улитки.
Отмечена спонтанная синергичная активность мотонейрона щупальца МтЦ3 и модуляторного нейрона МтЦ1 (первый метацеребральный нейрон), которая сопровождалась изменением амплитуды и, во многих случаях, частоты спонтанных осцилляций (9 препаратов наивных улиток). Кроме того, мы наблюдали спонтанную синергичную активность нейронов, лежащих в плевральных и педальных ганглиях (Пл1, первый плевральный нейрон и Пд4, четвертый педальный нейрон), причем эта синергичность имеет реципрокный характер. Оба эти нейрона получают синхронный гиперполяризующий вход (2 препарата наивных и 2 препарата обученных улиток).
Аналогичную спонтанную синергичную активность нейронов ЦНС и процеребрума, сопровождающуюся изменением частоты и амплитуды спонтанных осцилляций, также наблюдали и на полуинтактных препаратах улиток, обученных как пищевой, так и оборонительной реакции на запах цинеола. Эпизоды синергичной спонтанной активности на полуинтактных препаратах улиток, обученных аверсии на цинеол, наблюдали сразу в трех нейронах ЦНС (МтЦ3, МтЦ1, Пд4), процеребруме и церебро-буккальной коннективе (2 препарата). На полуинтактных препаратах улиток, обученных пищевой реакции на цинеол, была отмечена спонтанная синергичная активность нейронов ЦНС (МтЦ1, МтЦ3, Пд5в, пятый педальный вентральный нейрон), а также процеребрума и церебро-буккальной коннективы (3 препарата обученных улиток).
Такая спонтанная синергичная активность нейронов процеребрума и нейронов ЦНС, расположенных в разных ганглиях (церебральных плевральных, педальных), скорее всего, связана с общим возбуждающим входом на эти нейроны.
Роль процеребрума в регуляции активности мотонейрона щупальца.
Для определения количества синаптических переключений между клетками процеребрума и мотонейроном щупальца (МтЦ3, третий метацеребральный нейрон) в одной серии экспериментов мы проводили экстраклеточную стимуляцию клеток процеребрума и одновременно регистрировали активность мотонейрона МтЦ3, а в другой проводили внутриклеточную стимуляцию мотонейрона МтЦ3 и одновременно регистрировали суммарную активность процеребрума.
При экстраклеточной стимуляции процеребрума в нормальном физиологическом растворе наблюдали уменьшение спайковой активности в мотонейроне МтЦ3. Для определения количества синаптических переключений между процеребрумом и мотонейроном МтЦ3 (моно- или полисинаптическая связь) мы использовали раствор с повышенным содержанием кальция и магния (Hi-Di, 3x[Ca2+], 5x[Mg2+]) для блокады возможной полисинаптической связи между двумя этими структурами. После замены нормального физиологического раствора на раствор с повышенным содержанием кальция и магния (Hi-Di), экстраклеточная стимуляция процеребрума более не вызывала изменений спайковой активности МтЦ3 при такой же силе стимуляции (n = 3 эксперимента, Р = 0,89, критерий Стьюдента). Полученные данные говорят о том, что клетки процеребрума связаны с мотонейроном МтЦ3 не прямой моносинаптической связью (синапсом), а опосредованно, полисинаптически, не менее чем через два синаптических переключения.
В другой серии экспериментов мы исследовали наличие обратной связи со стороны мотонейрона щупальца на клетки процеребрума. При внутриклеточной деполяризации МтЦ3 ступенькой тока 2 нА (вызывающей многочисленные спайки) не отмечено никаких значимых изменений частоты и амплитуды осцилляций в процеребруме (n = 6 препаратов), это говорит о том, что обратного влияния со стороны МтЦ3 на клетки процеребрума нет. Дальнейшее увеличение частоты спайков (увеличением деполяризационного тока) в МтЦ3 также не приводило к изменению частоты и амплитуды осцилляций в процеребруме.
Поскольку процеребрум тормозит спайковую активность МтЦ3, торможение осцилляторной активности процеребрума может способствовать растормаживанию мотонейрона МтЦ3 и более длительному втягиванию щупальца в ответ на обонятельный стимул. Наоборот, активация процеребрума наивной улитки пищевыми запахами может быть необходима для снижения активности мотонейрона оборонительного поведения и, как следствие, вытягивания щупальца улитки для определения положения источника запаха, то есть активации пищевого поведения.
Chase и Hall (1996) предполагали существование двух афферентных путей: один (включает процеребрум) для восприятия низких концентраций запаха или пищевых запахов, и второй (независимый от процеребрума) для восприятия запахов в большой концентрации, опасных запахов. Определяемая активностью МтЦ3 величина сокращения щупальца на слабый запах может быть основой настройки обонятельной системы наземной улитки на присутствие определенного запаха в среде. Наоборот, тормозное влияние процеребрума на мотонейрон МтЦ3 может снижать его активность в ответ на пищевые запахи. Аверсивное обучение на запахи, возможно, вызывает снижение влияния процеребрума на мотонейрон МтЦ3 (Chase and Hall, 1996).
Выводы
1) Частота осцилляций электрической активности в процеребруме in vivo в отсутствие обонятельной стимуляции в два раза больше, чем частота осцилляций, зарегистрированных in vitro.
2) Частота и амплитуда осциляций в процеребруме в ответ на предъявление запаха in vivo претерпевают одновременные изменения: частота осцилляций снижается, а их амплитуда возрастает.
3) При исследовании препаратов необученных улиток in vitro, аппликация цинеола в концентрации 5% вызывает слабые, почти не отличающиеся от фонового уровня, изменения частоты и амплитуды осцилляций в процеребруме. При увеличении концентрации запаха цинеола до 20% наблюдается достоверное урежение осцилляций и уменьшение их амплитуды.
4) В группе улиток, обученных аверсивной реакции на цинеол, обнаружено, что аверсивная реакция вызывается вне зависимости от концентрации запаха и развёртывается полностью даже при малой концентрации одоранта.
5) В ответ на предъявление запаха цинеола в низкой 5%-ной концентрации улиткам, обученным пищевой реакции, происходят слабые изменения частоты и амплитуды осцилляций. При увеличении концентрации цинеола до 20% происходит достоверное увеличение частоты осцилляций.
6) Обнаружены спонтанные синергичные изменения осцилляций фокального потенциала в процеребруме и активности нейронов, участвующих в реализации пищевого и оборонительного поведения, которые, по-видимому, регулируются со стороны пока не идентифицированного центрального генератора паттернов.
7) Активация клеток процеребрума тормозит активность идентифицируемого мотонейрона щупальца МтЦ3, участвующего в реализации оборонительного поведения и может способствовать завершению оборонительной реакции. Обратного влияния со стороны нейрона МтЦ3 на процеребрум не обнаружено.
8) Полученные данные свидетельствуют о том, что изменения частоты и амплитуды спонтанных осцилляций в процеребруме в ответ на запах отражают участие процеребрума в ольфакторном обучении и выборе поведения в ответ на запах. Механизмом участия является тормозное влияние со стороны клеток процеребрума на нейроны оборонительного поведения, которое уменьшает длительность оборонительной реакции животного в ответ на запах и позволяет реализоваться пищевому поведению.
Список публикаций по теме диссертации
Статьи:
1. Nikitin E.S., Zakharov I.S., Samarova E.I., Kemenes G., Balaban P.M. Fine tuning of olfactory orientation behaviour by the interaction of oscillatory and single neuronal activity. Eur. J. Neurosci. 2005, 22(11), pp. 2833-2844.
2. Самарова Е.И., Балабан П.М. Регистрация спонтанных осцилляций в процеребруме наземной улитки Helix при свободном поведении. Журн. высш. нервн. деят., 2006, Т. 56, №6, с. 725-730.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ АВТОРА:
3. Gainutdinova T.H., Tagirova R.R., Ismailova A.I., Muranova L.N., Samarova E.I., Gainutdinov K.L., Balaban P.M. Reconsolidation of a context long-term memory in the terrestrial snail requires protein synthesis. Learn. Mem. 2005, 12(6), рр. 620-625.
4. Samarova E.I., Bravarenko N.I., Korshunova T.A., Gulyaeva N.V., Palotas A., Balaban P.M. Effect of - amyloid peptide on behavior and synaptic plasticity in terrestrial snail. Brain Res. Bull. 2005, 67(1-2), рр. 40-45.
Тезисы конференций:
1. Самарова Е.И. Нейрональные механизмы восприятия запаха у наземных улиток. «VIII Научная конференция молодых учёных», Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН., Москва, 6 октября 2004, стр. 24.