РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ И НЕЙРОФИЗИОЛОГИИ
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ВОСПРИЯТИЯ ЗАПАХОВ В НОРМЕ И ПРИ ОБУЧЕНИИ В ПРОСТОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЕ
САМАРОВА Е.И.
Москва -- 2006
Работа выполнена в лаборатории клеточной нейробиологии обучения (заведующий -- д. б. н., профессор П.М. Балабан) Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (директор -- д. б. н.,
профессор П. М. Балабан).
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор П. М. Балабан.
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук Г. Х. Мержанова;
доктор биологических наук А. С. Пивоваров.
Ведущая организация:
Институт биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН.
Защита состоится 31 января 2007 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета (Д-002.044.01) при Институте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (г. Москва, ул. Бутлерова, 5а).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИВНД и НФ РАН.
Автореферат разослан декабря 2006 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук
1. Общая характеристика работы
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Среди всех беспозвоночных животных спонтанная ритмическая осцилляторная активность мозга обнаружена только у наземных легочных моллюсков (улиток и слизней). Низкочастотные (~1 Гц) спонтанные осцилляции были описаны в процеребруме (ответственная за обоняние структура мозга) слизня Limax maximus (Gelperin and Tank, 1990; Kleinfeld et al, 1994), а также в процеребруме улитки Helix lucorum (Никитин и Балабан, 1999; Nikitin and Balaban, 2000).
В составе процеребрума насчитывают до 80 000 нейронов, в то время как во всех остальных ганглиях нервной системы улитки содержится всего около 20 000 нейронов. Поведение моллюсков довольно стереотипно и ограничено относительно простыми формами. Это позволяет исследовать организацию разных типов поведения на клеточном уровне, например, проследить связь активности нейронов процеребрума моллюска с идентифицированными нейронами, вовлеченными в реализацию конкурентных форм поведения (пищевого и оборонительного). Так, известно, что сокращением щупальца улитки в ответ на запах (оборонительное поведение) управляет группа мелких мотонейронов и крупный идентифицируемый метацеребральный мотонейрон щупальца (МтЦ3). Вклад этого мотонейрона в центральный компонент рефлекса втягивания щупальца составляет ~85% (Захаров и др., 1982; Prescott et al., 1997). Самый крупный нейрон церебральных ганглиев Ї первый метацеребральный нейрон (МтЦ1) Ї осуществляет модуляцию пищевого поведения у таких моллюсков как Helix (Chase and Tolloczko, 1992) и Lymnaea (Elliott and Susswein, 2002).
Считается, что осцилляции в процеребруме моллюсков играют важную роль в распознавании, запоминании и кодировании информации о запахе (Teyke and Gelperin, 1999), однако на сегодняшний день механизм участия осцилляций в этих процессах остается неизвестным. Кроме того, ни на одном объекте не изучены конкретные нейронные механизмы, регулирующие осцилляции в обонятельных структурах. Неизвестна также роль осцилляций в запуске моторной программы поведения животного. На данный момент осцилляторная активность процеребрума наземных улиток при восприятии запахов является единственным известным физиологическим феноменом, связывающим восприятие запахов с формированием поведения и является ключом к пониманию клеточных основ поведения у наземных моллюсков и выяснению нейронного кодирования обонятельной модальности у животных.
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Основной целью данной работы являлось изучение возможной роли процеребрума наземных улиток в реализации двух альтернативных форм поведения (пищевого или оборонительного поведения) в ответ на один и тот же запах (цинеол) у обученных условно-рефлекторной пищевой или оборонительной реакции и у необученных (наивных) животных.
В соответствии с поставленной целью исследования были определены следующие задачи:
1. Зарегистрировать и проанализировать осцилляторную активность процеребрума виноградных улиток in vivo и in vitro в условиях адекватной обонятельной стимуляции у необученных улиток и обученных условно-рефлекторной пищевой или аверсивной реакции на запах цинеола.
2. Зарегистрировать и сопоставить спонтанную осцилляторную активность процеребрума с активностью нейронов, вовлеченных в реализацию разных форм поведения виноградных улиток.
3. Изучить взаимоотношения между вызванной предъявлением запаха суммарной активностью клеток процеребрума и активностью мотонейрона щупальца МтЦ3 (третьего метацеребрального нейрона), принимающего участие в реализации оборонительного поведения.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.
1. Динамика изменения частоты и амплитуды спонтанных осцилляций в процеребруме в ответ на запах различается у обученных (пищевой или оборонительной реакции) и у необученных улиток, что отражает участие процеребрума в обучении и выборе поведения в ответ на запах.
2. Спонтанные изменения обонятельного ритма в процеребруме улитки коррелируют по времени с изменением активности идентифицированных нейронов в сетях управления конкурентными формами поведения (пищевым и оборонительным).
3. Активация клеток процеребрума вызывает торможение спонтанной спайковой активности мотонейрона щупальца МтЦ3, принимающего участие в реализации оборонительного поведения. Обратного влияния со стороны мотонейрона щупальца на клетки процеребрума не обнаружено. Тормозное влияние со стороны процеребрума может уменьшать длительность оборонительной реакции животного в ответ на запах, которая определяется уровнем активности мотонейрона щупальца.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые разработана методика экстраклеточного отведения активности процеребрума in vivo и проведена регистрация суммарной спонтанной и вызванной электрической активности процеребрума in vivo у наземного моллюска Helix lucorum L. Проведен анализ вызванной осцилляторной активности процеребрума in vivo и in vitro в ответ на предъявление запаха цинеола у необученных (наивных) и обученных (условно-рефлекторной пищевой или оборонительной реакции) улиток. Впервые показана спонтанная синергичная активность процеребрума и нейронов ЦНС, вовлеченных в реализацию двух конкурентных форм поведения улитки. Впервые обнаружено тормозное влияние нейронов процеребрума на активность мотонейрона щупальца МтЦ3 (третьего метацеребрального нейрона), принимающего участие в реализации оборонительного поведения. Описана роль процеребрума как центрального звена восприятия запахов при реализации двух конкурентных форм поведения виноградной улитки.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Анализ изменения осцилляторной активности в обонятельном мозге улитки в ответ на запах расширяет представления современной физиологии о роли сенсорной структуры в организации поведения. Описание влияния активности процеребрума на активность мотонейрона щупальца, принимающего участие в реализации оборонительного поведения, дополняет существующие представления о механизме выбора поведения животным.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные материалы диссертации были доложены на I Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (Сочи, Дагомыс, 2005), на 5-ом международном форуме FENS (Fifth Forum of European Neuroscience, Вена, Австрия, 2006), на 8-ой международной конференции ISIN (International Society for Invertebrate Neurobiology) "Простые нервные системы" (Казань, 2006), на конференциях молодых ученых ИВНД и НФ РАН (Москва, 2004, 2005, 2006).
ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и тезисы 6 докладов.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, глав с изложением методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на ____ страницах машинописного текста, иллюстрирована ____ рисунками. Список литературы содержит ____ источников.
2. Объект и методы исследования
Электрофизиологическая регистрация от процеребрума и нейронов ЦНС in vitro.
Работа выполнена на взрослых особях Helix lucorum L. крымской популяции. Для анестезии животных использовали изотонический раствор MgCl2. Из животного извлекали ЦНС с интактными обонятельными нервами и несущими обонятельный эпителий задними щупальцами (полуинтактный препарат). Препарат помещали в экспериментальную ванночку с раствором Рингера для холоднокровных (Rhines et al., 1993). Для обеспечения подачи запаха на обонятельный эпителий кожу щупальца вокруг сенсорного эпителия почти полностью удаляли. Щупальце прикалывали за мышцу ретрактора к подложке из силгарда, находившейся над уровнем физиологического раствора (Egan and Gelperin, 1981). Оболочки с процеребрума удаляли полностью или частично. Оболочки с нейронов других ганглиев ЦНС удаляли полностью. Для удаления наружных грубых оболочек с ЦНС препарат обрабатывали 7 минут протеазой (тип ХIV, Sigma, USA). Во время обработки ферментом обонятельный эпителий находился выше уровня физиологического раствора и не подвергался протеолитическому действию.
Электрофизиологическая регистрация.
В работе применяли синхронное экстраклеточное отведение суммарных потенциалов от процеребрума и церебро-буккальной коннективы и внутриклеточное отведение мембранного потенциала нейронов ЦНС улитки. Для электрофизиологического отведения активности в процеребруме использовали заполненный физиологическим раствором тонкий (внутренний диаметр 0,3 - 0,5 мм) стеклянный присасывающий электрод. Сигнал усиливался в 10 000 раз на усилителе (НБ-лаб, Россия) для регистрации экстраклеточной активности с предварительно установленной полосой пропускания 0,1-50 Гц. Экстраклеточную стимуляцию процеребрума проводили с помощью стимулятора ЭСЛ-2. Электрофизиологическое отведение суммарной активности церебро-буккальной коннективы проводили через вазелиновый мостик. Регистрирующий и индифферентный электроды, две серебряные хлорированные проволоки, находились по разные стороны от вазелинового мостика. Внутриклеточное отведение проводили по стандартной методике стеклянными микроэлектродами, заполненными раствором, содержащим 1.5М KCl и 1М KСH2CООН. Сопротивление кончика электрода составляло 10-50 МОм.
Предъявление запаха.
Предъявление запаха осуществляли с помощью ольфактометра (Kauer and Moulton, 1974), который позволяет дозировать концентрацию запаха в пределах 1-100% от максимальной. Потоки измеряли двумя флоуметрами (GF-1100, Gilmont Instruments, USA). Запах цинеола (жидкость) наносили до полного увлажнения на фильтровальную бумагу, которую помещали в сменную камеру. Перед подачей на препарат поток запаха и чистого воздуха смешивали в смесителе для достижения нужной концентрации запаха. Из смесителя запах поступал в подающую пипетку, из которой с помощью вакуумного насоса откачивали содержимое со скоростью, бульшей чем скорость поступления смеси с запахом. Запах предъявляли путем прекращения активного отсоса запаха из кончика подающей пипетки, Длительность подачи запаха - 3 с. В качестве одоранта использовали цинеол - мономолекулярный запах. Цинеол предъявляли только в возрастающих концентрациях (1, 2, 5, 10, 20%). Время между предъявлениями запаха около 15 мин. Электрофизиологические записи осцилляторной активности процеребрума обрабатывали с помощью программ Spike2 5.0 (SED, UK), Origin 6.0 (OriginLab, USA).
Эксперименты с поведением и обучением улиток на запах.
В работе использовали протокол выработки условного рефлекса в специальной экспериментальной установке (Balaban et al., 1987). При выработке условнорефлекторной аверсивной реакции на цинеол удары током (~110 мА, 0,5 с, 10 Гц) после предъявления цинеола наносили металлическим электродом, который вручную подносили к ноге. При выработке аверсии в ответ на запах цинеола удар током наносили через ~10 с после начала подачи запаха. Всего в группе было 20 животных. Обучение проводили за 15-20 дней, осуществляя по два сочетания в день. При выработке условнорефлекторной пищевой реакции на цинеол обучение проводили по сходной методике, что и аверсивное обучение, только предъявление запаха цинеола подкрепляли морковным соком. Несколько капель морковного сока предъявляли через несколько секунд после предъявления запаха улитке. В группе было 20 животных. Обучение проводили в течение 15-20 дней, осуществляя по четыре-пять сочетаний в день. Тестирование выработанного условного рефлекса (пищевого или аверсивного) проводили в открытом поле с использованием слепого контроля и видеозаписью поведения животного в ответ на появление цинеола в среде. Сразу после тестирования в открытом поле улиток препарировали и на полуинтактном препарате «обонятельный орган - ЦНС» животных регистрировали осцилляторную активность процеребрума в ответ на запах цинеола, наносимый с расстояния 0,5-1,0 см от рецепторного эпителия.
Электрофизиологическая регистрация от процеребрума in vivo и проведение операций.
В экспериментах использовали половозрелых улиток Helix lucorum и Helix pomatia (n=17). Перед началом операции улиток анестезировали охлаждением, затем вводили сукцинилхолин хлорид (Sigma, USA) и MgCl2 (200 мM, 2 мл). Сукцинилхолин хлорид разводили на изотоническом растворе MgCl2 и вводили в тело улитки; предполагаемая конечная доза вещества внутри тела улитки составляла 0,012 мг (Balaban and Chase, 1989).
Проведение операций по вживлению хронических электродов в процеребрум улиток.
Через разрез (1-1,2 см) на коже головы позади верхних щупалец вводили тонкий платино-иридиевый проволочный электрод диаметром 20 мкм с изоляционным тефлоновым покрытием (A-M Systems, Inc., USA). Электрод проводили от внутренней стороны мантии вдоль тела и укрепляли за соединительнотканные оболочки церебральных ганглиев ЦНС улитки. Электрод устанавливали в апикальной либо центральной части процеребрума, после чего разрез на коже зашивали шовным материалом. После операции выживало около 23% животных. Регистрацию осцилляторной активности в процеребруме начинали через 18-24 ч после операции, когда улитки начинали активно ползать, и проводили (с перерывами) в течение последующих 2-3 дней. На третий-четвёртый день животное забивали и проводили морфологический контроль для выяснения точного местоположения электрода в мозге.
| Презентация |