Регистрацию суммарной электрической активности процеребрума в ответ на аппликацию запаха проводили по стандартной методике с помощью экстраклеточного усилителя (НБ-лаб, Россия). Предъявление запаха осуществляли с помощью ольфактометра (описание см. выше). В качестве одоранта использовали цинеол. Для определения латентного периода реакции животного на запах параллельно проводили видеорегистрацию поведения на камеру JVC F1.2 (Япония). Видеозаписи поведения обрабатывали с помощью программы Pinnacle Studio 9.0, электрофизиологические записи осцилляторной активности обрабатывали с помощью программ Spike2 5.0 (SED, UK), Origin 6.0 (OriginLab, USA).
3. Результаты и обсуждение
Спонтанные осцилляции в процеребруме улиток.
Электрофизиологическая регистрация активности в процеребруме улиток Helix как с помощью стеклянного присасывающего электорода (in vitro регистрация), так и с использованием вживленного хронического электорода в процеребрум (in vivo регистрация) показала наличие спонтанных ритмических осцилляций в процеребруме. При экстраклеточной регистрации активности процеребрума на полуинтактном препарате (in vitro регистрация) спонтанные осцилляции демонстрируют высокую регулярность на протяжении достаточно длительного времени (час и более) и имеют более или менее постоянную частоту и амплитуду. В свободном поведении (при in vivo регистрации) амплитуда, частота и форма осцилляций у наземных улиток были менее постоянными и предсказуемыми.
Частота спонтанных осцилляций в процеребруме наивной улитки в свободном поведении, в отличие от частоты обонятельного ритма на полуинтактном препарате, в большинстве случаев была больше 1 Гц. Средняя частота осцилляций, зарегистрированных in vivo, составляла 1,16 ± 0,08 Гц, что почти в два раза больше, чем частота спонтанных осцилляций до предъявления запаха на полуинтактном препарате как у наивных улиток, так и улиток, с выработанной условнорефлекторной пищевой или оборонительной реакцией на запах цинеола. При in vitro регистрации осцилляций в процеребруме наивных улиток частота осцилляций редко превышала 1 Гц, а средняя частота осцилляций составляла 0,68 ± 0,09 Гц, достоверно (р < 0,05, критерий Данна) отличаясь от частоты осцилляций при регистрации in vivo. В группе препаратов, полученных из обученных пищевой реакции на запах цинеола улиток, средняя частота осцилляций in vitro до нанесения запаха составляла 0,65 ± 0,05 Гц, достоверно не отличаясь от средней частоты осцилляций в процеребруме наивных улиток in vitro. На полуинтактных препаратах улиток, обученных оборонительной реакции на запах цинеола, не наблюдали ни одного случая, когда частота осцилляций в фоне до момента нанесения запаха на препарат превышала 1 Гц. Средняя частота осцилляций у таких улиток составляла 0,6 ± 0,04 Гц.
Амплитуда осцилляций в процеребруме, зарегистрированных как in vivo, так и in vitro, также различалась у разных групп животных, зависела от неизвестных факторов. Средняя амплитуда осцилляций в фоне (до предъявления запаха цинеола) in vivo составляла 65,5 ± 4,07 мкВ. Средняя амплитуда осцилляций, зарегистрированных in vitro, была достоверно (р < 0,05, критерий Данна) меньше - у наивных улиток 46,8 ± 4,02 мкВ и улиток, обученных пищевой реакции на цинеол, 35,2 ± 2,23 мкВ. Средняя амплитуда осцилляций, зарегистрированных in vitro у улиток с выработанной аверсией на цинеол была недостоверно больше (110,34 ± 16,44 мкВ), чем амплитуда осцилляций in vivo, что может быть связано с сильной сенситизацией улиток к данному запаху во время обучения.
Впервые спонтанная активность процеребрума in vitro была проанализирована в деталях у слизня Limax maximus (Gelperin and Tank, 1990). Позднее были зарегистрированы спонтанные ритмичные осцилляции в процеребруме у наземной улитки Helix lucorum (Chase and Hall, 1996; Никитин и Балабан, 1999). До сих пор неизвестно значение этого спонтанного осцилляторного ритма процеребрума, однако считается, что волна возбуждения вызывает синхронизацию работы большого количества клеток процеребрума и тем самым способствует более точной настройке всей системы на выделение новых, в том числе очень слабых, источников запаха из окружающей среды, содержащей множество одорантов (Laurent, 1996).
Изменение осцилляций в процеребруме под воздействием запаха.
При регистрации осцилляций в процеребруме с помощью вживленного платино-иридиевого электрода (регистрация in vivo) параметры электрической активности обонятельного мозга наземных моллюсков претерпевают значительные изменения при появлении в обстановке нового запаха. С помощью видеорегистрации поведения улитки (изменения длины щупальца улитки в ответ на запах) синхронно с регистрацией осцилляторной активности процеребрума нам удалось сравнить электрофизиологическую регистрацию с поведением.
Достоверное изменение частоты осцилляций в процеребруме отмечено уже в первые 10 c после подачи запаха цинеола (5%), в течение которых частота снижается на 10% (р < 0,05, здесь и далее критерий Манна-Уитни). Одновременно со снижением частоты осцилляций происходит и достоверное (р < 0,01) увеличение амплитуды осцилляций на 12%. Важно отметить, что основная оборонительная реакция улитки - сокращение щупальца в ответ на запах - очень хорошо выражена именно в первые 10 с после подачи запаха. Например, максимальное сокращение длины щупальца в ответ на предъявление запаха в 5%-ной концентрации достигается уже к третьей секунде от начала подачи запаха животному, после чего происходит быстрое восстановление длины щупальца. К 9-10-ой секунде щупальце почти полностью восстанавливает свою длину (до 80%), по крайней мере, сенсорный эпителий к этому времени уже открыт и улитка может вновь воспринимать запахи.
Достоверные изменения частоты и амплитуды осцилляторного ритма в процеребруме улитки Helix при регистрации in vivo наблюдали в интервале 21-30 с и 31-40 с после подачи запаха цинеола в концентрации 5%. В эти временные периоды происходит увеличение амплитуды осцилляций на 16% (в интервале 21-30 с) и 11% (в интервале 31-40 с), а также снижение частоты осцилляций на 14% (в интервале 21-30 с) и 18% (в интервале 31-40 с).
При исследовании поведения улитки в ответ на предъявление цинеола в 20% концентрации было отмечено, что максимальное втягивание щупальца было на 4-ой с после начала подачи запаха, после чего происходило медленное увеличение длины щупальца. Надо отметить, что длина щупальца в ответ на 20% концентрацию цинеола была достоверно меньше, чем длина щупальца в ответ на 5%-ный цинеол. После втягивания щупальца, повторное появление сенсорного эпителия на его поверхности (т.е. способность воспринимать запахи) происходит только на 11-12-ой с после подачи запаха. В это время вновь начинается активное сканирование пространства, т. е. появляется адекватная реакция улитки на появление нового запаха в среде.
При восприятии животным запаха цинеола (20%) достоверные изменения, как частоты так и амплитуды осцилляций в процеребруме происходят в период 11-20 с после момента предъявления запаха. При этом частота достоверно (р < 0,05) снижается на 12% по сравнению в первоначальным уровнем, а амплитуда достоверно (р < 0,01) увеличивается на 25% от фонового значения. Такие синхронные изменения частоты и амплитуды осцилляций при восприятии запаха подтверждают гипотезу о неразрывной связи этих двух параметров в механизмах распознавания запаха животным. Таким образом, частота и амплитуда осцилляций процеребрума in vivo в ответ на предъявление запаха претерпевают одновременные изменения в виде урежения осцилляций, сопровождаемого увеличением их амплитуды.
При регистрации на полуинтактном препарате (in vitro) амплитуда осцилляторного ритма в процеребруме у наивных улиток в ответ на предъявление запаха цинеола (5%) увеличивалась в интервале 21-30 с (на 7%) и 31-40 с (на 9%) от момента предъявления запаха. В интервале 1-20 с после подачи цинеола (5%) достоверных изменений амплитуды осцилляций не происходило, хотя наблюдали тенденцию к уменьшению амплитуды осцилляций. Достоверное уменьшение частоты осцилляций (р < 0,01) в процеребруме наблюдали в интервале с 1 по 20 с (на 20% и 36%) от момента начала подачи запаха (5%).
После аппликации цинеола в большой концентрации (20%) наблюдали достоверное (р < 0,001) уменьшение амплитуды осцилляций на 10% в интервале 11-20 с от момента подачи запаха. В том же самом интервале времени (11-20 с от момента предъявления запаха на препарат) наблюдали достоверное (р < 0,001) урежение осцилляций на 40%. Частота осцилляторного ритма возвращалась в норму только через 30 с после подачи запаха на препарат. осцилляторный процеребрум обонятельный аверсивный
Необходимо заметить, что в случае регистрации осцилляций на полуинтактном препарате возможная длительность восприятия запаха не может быть меньше 3 с (длительность нанесения стимула), так как щупальце не может втянуться, и сенсорный эпителий открыт в течение всего времени предъявления запаха. Это может являться основой отличий в изменении амплитуды осцилляций в ответ на цинеол in vivo и in vitro. Следует также отметить, что цинеол в большой концентрации (20%) является очень сильным раздражителем, который может вызывать скорее аверсивную реакцию у животного (или препарата), нежели ориентировочно-исследовательскую.
Для выявления того, какая реакция процеребрума на запах соответствует выбору и реализации нервной системой програмы пищевого или оборонительного поведения, в дальнейших экспериментах проводили обучение улиток условнорефлекторной пищевой или оборонительной (аверсивной) реакции на запах цинеола.
В свободном поведении улитки, обученные аверсии на цинеол, в ответ на запах цинеола проявляли сильно выраженную оборонительную реакцию, которая проявляется в длительном втягивании щупалец и даже в замедлении локомоции, повороте в другую сторону для избегания встречи с источником неприятного запаха. В открытом поле такие улитки старались не приближаться к источнику неприятного запаха и, часто, уползали в другую сторону, либо прекращали локомоцию вовсе и прятались в раковину. Улитки, обученные пищевой реакции на цинеол, наоборот, в открытом поле проявляли сильно выраженное предпочтение к данному запаху и очень быстро (5-7 мин) достигали пробирки, источающей запах цинеола.
Достоверное (р < 0,001) уменьшение амплитуды (на 16%) осцилляций в процеребруме (in vitro) улитки, обученной условнорефлекторной аверсивной реакции на запах цинеола, происходило в ответ на аппликацию цинеола (5%) в интервале 11-20 с после подачи запаха. В интервале 21-30 с после подачи цинеола (5%) также происходило достоверное снижение амплитуды осцилляций (р < 0,05), но всего на 7%. Достоверное снижение частоты осцилляций в процеребруме (р < 0,01) заметно уже в первые 10 с после начала подачи цинеола на препарат. Максимальное урежение осцилляций -- на 53% -- наблюдали в интервале 11-20 с после подачи запаха (5%), т. е. тогда, когда происходит и максимальное уменьшение амплитуды осцилляций (на 16%). Урежение осцилляций (на 20%) сохранялось и в интервале 21-30 с после подачи цинеола (5%), что также коррелировало со снижением амплитуды осцилляций в тот же временной период. В дальнейшем частота осцилляторного ритма постепенно возвращалась в норму по сравнению с первоначальным уровнем частоты до нанесения запаха.
После предъявления цинеола в концентрации 20% достоверное (р < 0,001) снижение амплитуды осцилляций на 23% наблюдали во второй десятисекундный интервал (11-20 с) после начала предъявления запаха. Такое снижение амплитуды осцилляций происходило синхронно (в тот же самый временной интервал) с падением частоты осцилляций практически в два раза. Достоверное снижение частоты и амплитуды осцилляций продолжалось и в интервал 21-30 с: снижение частоты на 26% и амплитуды на 9%, после чего амплитуда и частота осцилляций быстро возвращались к первоначальной величине до подачи запаха на препарат.
Максимальные изменения осцилляций в процеребруме улиток, обученных аверсивной реакции, на полуинтактном препарате отмечены во второй 10-секундный интервал (11-20 с), что, возможно, определяет время принятия решения о реализации оборонительного поведения на данный сенсорный раздражитель (запах). Длительность реакции также слабо зависит от концентрации раздражителя (цинеола) в среде, что говорит о том, что более важной является качественная характеристика раздражителя, определение которой происходит в первые секунды после нанесения одоранта на препарат. Можно сделать предположение, что данный временной период может быть существенным для принятия решения о реализации генерализованного оборонительного поведения животным для удаления от источника неприятного или опасного запаха (escape reaction).
Важно отметить, что в ответ на предъявление цинеола в большой концентрации (20%) изменения частоты осцилляций в процеребруме in vitro в группе улиток, обученных аверсивной реакции, и наивных улиток достоверно не различались ни на одном из 10 секундных интервалов. Но у улиток, обученных аверсивной реакции, изменения частоты осцилляций были недостоверно более выражены. Это обстотельство может свидетельствовать о том, что такая большая концентрация запаха (20%) может вызывать аверсию у животных обеих групп.
Поведение улиток (изменение длины щупальца), обученных пищевой реакции на запах цинеола, слабо различалось при подаче цинеола в низкой и большой концентрациях. Максимальное втягивание щупальца (в среднем на 50-55%) наблюдали уже на первой секунде от начала подачи запаха животному. При этом уже на 4-ой секунде после начала подачи запаха цинеола 5% (на 5-ой с при подаче цинеола 20%) щупальце практически полностью (до 80%) восстанавливало свою длину и сенсорный эпителий к тому времени был уже открыт. После четвёртой секунды от подачи запаха щупальца сильно вытягиваются в длину, и улитка начинает активно двигаться к источнику запаха.