Как показано стрелкой на рис. 1Б, домен С4 содержит высококонсервативный остаток серина/треонина в составе мотива RRTLT/SGP, являющегося классическим (mode II) для связи с регуляторными белками 14-3-3. Поскольку известно, что белки 14-3-3 среди прочих функций также принимают участие в сигнальной трансдукции, и при этом их количество в разных видах растений разнообразно, это послужило причиной нашего к ним интереса в контексте устойчивости Thellungiella к неблагоприятным условиям среды.
Анализ экспрессии генов TsABF. Из литературных источников известно, что Thellungiella обладает повышенной устойчивостью к воздействию высоких концентраций солей в почве, поэтому мы провели анализ зависимости экспрессии генов ABF в Thellungiella от действия данного стрессового фактора. Анализ был проведен с помощью ПЦР в реальном времени с использованием праймеров, специфичных к отдельным генам TsABF. Как показано на рис. 2, экспрессия генов TsABF2, TsABF3 и TsABF4 значительно увеличивалась под влиянием солевого стресса. Наибольшее увеличение экспрессии наблюдалось для гена TsABF2.
Рис. 2. Экспрессия генов ABF в растениях Thellungiella (экотип Yakutsk), подверженных воздействию 200mM NaCl. А - экспрессия генов в надземной части растения, Б - экпрессия генов в корнях растения. Точки обозначают среднее значение ± 95% C.I. (N=3).
В целом, повышенная в среде концентрация NaCl вызывала быстрое увеличение уровня экспрессии генов TsABF в надземной части с пиками значений через 2 и 8 часов после начала обработки, после чего уровень экспрессии понижался до значений, сопоставимых с экспрессией в контрольной группе (без стресса). Экспрессия же гена TsABF1 под влиянием солевого стресса практически не менялась (результаты не приведены). Наряду с данными, свидетельствующими в пользу схожести выполняемых факторами транскрипции ABF функций, наблюдаемые в настоящей работе и в ряде работ других авторов определенные отличия в экспрессии кодирующих их генов свидетельствуют также и в пользу некоторой специфичности их действия(Choi et al. 2000; Kim et al. 2004; Fujita et al. 2005). В дополнение к этому следует отметить, что Thellungiella от других растений отличает также быстрая индукция экспрессии генов ABF (наибольший рост отмечался через 2-8 часов после начала обработки) в ответ на стрессовое воздействие. Например, в аналогичных экспериментах в Arabidopsis экспрессия генов ABF значительно возрастала в среднем лишь через 18-24 часов после начала воздействия солевого стресса (Uno et al. 2000; Fujita et al. 2005).
Помимо регуляции на уровне транскрипции белки ABF также подвергаются посттрансляционной регуляции, таким как фосфорилирование и последующие за ним изменения, а также протеолитической деградации и т.п. (Choi et al. 2005; Kobayashi et al. 2005; Fujii et al. 2007; Sirichandra et al. 2010). Несмотря на обнаруженную способность протеинкиназ из семейства SNRK2 фосфорилировать и активировать белки ABF под действием стресса, механизм таковой активации до недавнего времени был неясен (Kobayashi et al. 2005; Fujita et al. 2009). Вопрос о том, что фосфорилирование дает с функциональной точки зрения для факторов транскрипции ABF, стал косвенно проясняться, когда в ходе анализа библиотеки генов ячменя было обнаружено, что белки ABF, а также близкородственный им фактор транскрипции ABI5, взаимодействуют с белками 14-3-3 (Schoonheim et al. 2007a; Schoonheim et al. 2007b; Schoonheim et al. 2009). Известно, что 14-3-3 образуют большое семейство белков, осуществляющих широкий спектр регуляторных функций посредством связывания со специфичными фосфорилированными мотивами регулируемых ими белков. В недавней литературе появились косвенные свидетельства в пользу того, что АБК-зависимое фосфорилирование факторов транскрипции ABF, а также последующее их взаимодействие с регуляторными белками 14-3-3 предотвращает деградацию первых, тем самым оказывая косвенное влияние на процесс регуляции транскрипции факторами ABF (Sirichandra et al. 2010).
Идентификация генов 14-3-3. С целью анализа структуры белков 14-3-3 в Thellungiella, а также с целью проверки возможности их взаимодействия с факторами транскрипции ABF была проведена работа по идентификации и установлению полных нуклеотидных последовательностей генов 14-3-3 в растениях Thellungiella. На первом этапе в базе данных GenBank на сервере NCBI по транскриптому Thellungiella были обнаружены 4 последовательности EST, гомологичные фрагментам генов 14-3-3, кодирующих изоформы Chi, Epsilon, Omega и Mu из Arabidopsis. Кроме того, используя подобранные на основе гомологии с Arabidopsis праймеры, нам удалось амплифицировать фрагменты еще 5 генов 14-3-3, кодирующих изоформы Lambda, Omicron, Phi, Psi и Upsilon. Все фрагменты были клонированы в векторе pGEM-T, после чего была установлена их нуклеотидная последовательность. Методом RACE-PCR были установлены полные нуклеотидные последовательности идентифицированных генов. Все идентифицированные последовательности были зарегистрированы в GenBank. Выявленным изоформам белков 14-3-3 были даны названия в соответствии с гомологичным им белкам из Arabidopsis.
Рис. 3. Выравнивание аминокислотных последовательностей идентифицированных изоформ Ts14-3-3 (А), а также сравнительное выравнивание С-концевых фрагментов наиболее отличных изоформ Ts14-3-3 с их аналогами из Arabidopsis (Б). Аминокислотные остатки, выделенные черным цветом, являются полностью идентичными, выделенные серым цветом - идентичны на 50-80%. Выравнивание было проведено с использованием программы ClustalW.
Гомология аминокислотных последовательностей изоформ 14-3-3 Thellungiella и Arabidopsis составила от 88 до 95 %. Все идентифицированные белки 14-3-3 содержат высококонсервативный центральный домен и, в то же время, имеют вариабельные N- и С-концевые последовательности, что характерно для данного семейства (рис. 3А). Однако, С-концевые фрагменты изоформ 14-3-3 Chi, Mu и Omicron из Thellungiella существенно отличаются от таковых из Arabidopsis, что отображено на рис. 3Б. Изоформа Ts14-3-3 Epsilon также отличается от аналогичной из Arabidopsis главным образом своей С-концевой последовательностью. Необходимо отметить, что по литературным данным именно С-концевые фрагменты белков 14-3-3 отвечают за специфичность их взаимодействия с белками-мишенями (Shen et al. 2003; Bornke 2005; Visconti et al. 2008).
Различия в С-концевых доменах, как было отмечено в литературе, могут играть важную роль в определении специфичности отдельных белков (Obsilova et al. 2004; Silhan et al. 2004; Bornke 2005; Sinnige et al. 2005). Так, к примеру, было показано, что взаимодействие изоформы GF14-6 кукурузы с H+-АТФазой зависит от С-концевого домена белка GF14-6. Делеционный анализ белка GF14-6 выявил, что интенсивность взаимодействия GF14-6 с H+-АТФазой меняется, при этом меняется также и активность самой H+-АТФазы (Visconti et al. 2008).
Оценка экспресси генов 14-3-3 в растениях Thellungiella. Поскольку в Thellungiella обнаружено большое количество изоформ 14-3-3, возник вопрос, имеет ли место специфичность в экспрессии генов отдельных изоформ 14-3-3 в разных органах растений и как она меняется в зависимости от внешних воздействий? На рис. 4 представлены данные по экспрессии генов 14-3-3 в разных органах растений. Большинство генов, за исключением Mu и Psi, демонстрировали высокий уровень экспрессии в листьях и цветках. Экспрессия гена 14-3-3 Psi была невысокой во всех органах, а экспрессия гена 14-3-3 Mu была крайне низка, что было подтверждено с использованием разных пар праймеров при постановке ПЦР.
Рис. 4. Анализ экспрессии генов 14-3-3 в разных органах растений Thellungiella методом ОТ-ПЦР. СТ - стручки, ЦН - цветоножки, ЦВ - цветки, ЛС - листья, КР - корни. Экспрессию гена Actin использовали в качестве стандарта.
Некоторые отличия в профилях экспрессии отдельных генов могут свидетельствовать в пользу специфичности их функций, однако тем не менее наблюдаемое сходство является также аргументом в пользу общности функций, выполняемых кодируемыми ими белками.
Используя ОТ-ПЦР в реальном времени, нами были измерены изменения в экспрессии генов 14-3-3 в ответ на действие таких стрессовых факторов, как повышенная концентрация соли (200 mM NaCl) в среде и пониженная температура (4° С). Экспрессия большинства из анализируемых генов возрастала (до 2,5 раз относительно контроля) в ответ на действие повышенной концентрации соли в растворе, хотя данный эффект и носил кратковременный характер. Уже через 8 часов после того, как растения были подвержены стрессовому воздействию, экспрессия генов возвращалась на уровень, сопоставимый с экспрессией в стандартных условиях. Также, действие пониженной температуры приводило к небольшому повышению уровня экспрессии генов 14-3-3 ч, е и ц.
Помимо регуляции на уровне экспрессии генов происходят также и посттрансляционные изменения активности белков, чья функция связана с адаптацией растений к стрессовым воздействиям. Как было упомянуто ранее, в недавних исследованиях было обнаружено, что белки 14-3-3 взаимодействуют с факторами транскрипции ABF. Однако встает вопрос о роли многообразия форм белков 14-3-3 в различных растениях, и, в частности, в Thellungiella. Большое количество изоформ 14-3-3, как предполагают исследователи, может служить предпосылкой существования определенной специфичности во взаимодействии с белками-мишенями. В то же время, такое многообразие может служить и причиной замещаемости функций одних изоформ другими. Тем не менее, в литературе, наряду со свидетельствами в пользу взаимозаменяемости изоформ 14-3-3, имеются также данные, указывающие на специфичность их функций.
Оценка взаимодействия факторов транскрипции TsABF с белками 14-3-3. Проверку взаимодействия факторов транскрипции TsABF с белками 14-3-3 проводили дрожжевым двугибридным анализом. Для этого было создано 8 генетических конструкций, кодирующих химерные белки, состоящие из домена связывания (BD) дрожжевого фактора транскрипции GAL4 и сшитого с ним гена одной из изоформ 14-3-3. Также были созданы 2 конструкции, кодирующие химерные белки, состоящие из домена активации (AD) GAL4 и сшитого с ним гена TsABF2 или TsABF4, несущих в их С-концевой области мотивы для связывания белков 14-3-3: RRTESGP у TsABF2 и RRTLTGP у TsABF4. Помимо этого, была создана генетическая конструкция, кодирующая химерный белок, состоящий из домена AD и сшитой с ним мутантной формы TsABF2S393A, в которой замена серина на аланин в мотиве RRTESGP в соответствие с литературными данными (Yaffe et al. 1997) должна полностью блокировать связывание между TsABF2 и белками 14-3-3.
Рис. 5. Результаты качественного дрожжевого двугибридного анализа. TsABF2S393A - мутантная форма белка TsABF2 с заменой серина в позиции 393 на аланин. Клеточную культуру дрожжей, трансформированную парой генетических конструкций, точечно наносили на селективную среду SD-LWHA.
Как видно из рис. 5, на селективной среде SD-LWHA способны расти клетки дрожжей штамма PJ69-4A, экспрессирующие 6 из 8 анализируемых изоформ 14-3-3, причем этот результат практически одинаков для обеих изоформ ABF. Примечательно, что клетки, несущие изоформы 14-3-3 Epsilon, Omicron и Phi росли на селективной среде слабо либо не росли вовсе. Точечная мутация по замене аминокислотного остатка серина в позиции 393 на аланин привела к полной потере способности клеток дрожжей расти на селективной среде SD-LWHA.
Для количественной оценки интенсивности взаимодействия исследуемых белков мы проанализировали активность в-галактозидазы, обусловленную уровнем экспрессии репортерного гена LacZ. Результаты анализа представлены на рис. 6.
Рис. 6. Количественная оценка интенсивности взаимодействия белков 14-3-3 с факторами транскрипции ABF. Точки обозначают среднее значение ± 95% C.I. (N=3).
Из рисунка видно, что интенсивности взаимодействий исследуемых белков существенно различаются между собой, причем наибольшей активностью в этом тесте обладала изоформа 14-3-3 Chi, наименьшей - изоформа 14-3-3Phi. Кроме этого видно, что точечная мутация S393A в гене TsABF2 привела к полному блокированию активности в-галактозидазы, что лишний раз подтверждает, что обнаруженный мотив RRTESGP в белке TsABF2 и его вероятное фосфорилировнаие по серину являются критическим для связывания с белками 14-3-3 и что полученные в данном исследовании результаты на основе дрожжевого двугибридного анализа не являются артефактом.
Заключение
Одним из ключевых элементов в механизме регуляции зависимой от действия АБК экспрессии генов, являются факторы транскрипции ABF. В нашем исследовании мы идентифицировали и охарактеризовали четыре гена, кодирующих факторы транскрипции семейства ABF из растения Thellungiella salsuginea.
В ходе работы было выявлено, что аминокислотные последовательности факторов транскрипции ABF из Thellungiella содержат 5 характерных для всех белков данного семейства консервативных доменов. В то же время, рассматриваемые факторы транскрипции отличаются от таковых из Arabidopsis главным образом их междоменными областями. Отличия аминокислотных последовательностей могут служить причиной разной функциональной активности белков, поэтому необходимо дальнейшее сравнительное изучение данных белков в рассматриваемых видах растений. Следует также отметить, что обнаруженный у факторов транскрипции TsABF потенциальный мотив для связывания с белками 14-3-3 является практически идентичным во всех изоформах TsABF1-4, что свидетельствует о важности данного мотива для реализации физиологических функций белков ABF.
Измерение экспрессии исследуемых генов в условиях стресса показало их высокую индуцибельность. Более того, быстрая индукция экспрессии генов, связанных с адаптацией к стрессовым воздействиям (наибольший рост отмечался уже через 2-8 часов), характерна для Thellungiella, что свидетельствует о существовании в этом растении механизмов регуляции экспрессии генов, вероятно обуславливающих его преимущества как экстремофила.
Разнообразие изоформ 14-3-3, взаимодействующих с факторами транскрипции ABF, может приводить к формированию гомо- и гетеродимерных комплексов с различными партнерами, такими как разные изоформы ABF, а, возможно, и другие белки транскрипционного аппарата клетки. В случае с белками 14-3-3 из Thellungiella, это могут быть и уникальные комплексы, поскольку С-концевые домены отдельных изоформ существенно отличаются от таковых из Arabidopsis.
Кроме этого, белки 14-3-3 могут регулировать активность связывания ДНК факторами транскрипции. Так, было показано, что взаимодействие белков p53 c регуляторными белками 14-3-3 человека приводит к более эффективному формированию функционально активных тетрамеров фактора транскрипции. Было доказано, что фомирование такого комплекса существенно повышает эффективность связывания p53 с ДНК (Rajagopalan et. al. 2008). Более того, белки 14-3-3 способны связывать несколько мономеров, димеров или даже тетрамеров в более сложные структуры, выступая в роли каркасных белков, как в случае с фактором транскрипции p53 человека (Rajagopalan et. al. 2008). В этой связи необходимо отметить, что отличия белков 14-3-3 растений Thellungiella могут служить фактором, обусловливающим возникновение уникальных сложных белковых структур, играющих важную роль в регуляции процессов адаптации этого растения.