На правах рукописи
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Идентификация в растении Thellungiella salsuginea (Pall.) генов TsABF и Ts14-3-3, анализ взаимодействия кодируемых ими белков
03.01.06. - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)
Высоцкий Денис Александрович
Москва 2013
Работа выполнена в лаборатории стрессоустойчивости растений Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии Россельхозакадемии (г. Москва).
Научный руководитель:
Бабаков Алексей Владимирович, доктор биологических наук, профессор
Официальные оппоненты:
Соловьев Александр Александрович, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой генетики и биотехнологии РГАУ-МСХА
Комахин Роман Александрович, кандидат биологических наук, заведующий лабораторией индуцированного рекомбиногенеза ВНИИСБ
Ведущая организация:
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН (г. Москва)
Защита состоится « » 2013 г. в__ часов на заседании диссертационного совета Д.006.027.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии по адресу: 127550, Москва, Тимирязевская 42. Тел.: (499) 976-65-44, факс: (499) 977-09-47, e-mail: iab@iab.ac.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии.
Автореферат разослан «___» ____________ 2013 г., размещен на Интернет-сайте www.vniisb.ru. «___» ____________ 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
Кандидат биологических наук Вобликова В.Д.
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Абиотические стрессовые воздействия, такие как повышенные и пониженные температуры, засуха, засоление почв, отрицательные температуры, тяжелые металлы и т.п. являются основными факторами, способными снижать урожайность культурных растений на 70% (Boyer 1982). При этом, высокая степень засоления почв и длительная засуха обладают самыми пагубными последствиями, приводя к жесткому дефициту влаги (Yoshida et al. 2010). На сегодняшний день, немалая доля пахотных земель находится в зонах, подверженных данным стрессовым воздействиям (Kogan 1997).
Изучение механизмов передачи стрессорного сигнала имеет важнейшее фундаментальное значение для понимания процесса адаптации растительных клеток к стрессовым факторам. В зависимости от типа и характера стрессового воздействия, растения и отдельные их клетки используют различные механизмы передачи сигнала, приводящие, в конечном итоге, к изменению экспрессии сотен генов (Новикова et al. 2007; Huang et al. 2012). Одним из основных механизмов, определяющим физиологический ответ растительной клетки на осмотический стресс является передача сигнала, регулируемого фитогормоном абсцизовой кислоты (АБК). Несмотря на то, что АБК влияет на множество физиологических и биохимических процессов в растениях, основной ее функцией является регуляция водного баланса растения и адаптация к осмотическому стрессу (Schroeder et al. 2001; Finkelstein et al. 2002; Zhu 2002; Himmelbach et al. 2003). В условиях солевого стресса АБК запускает в клетках каскады реакций, приводящие к изменению экспрессии многих генов (Hoth et al. 2002; Seki et al. 2002; Takahashi et al. 2004). Несмотря на достигнутые успехи в понимании механизмов передачи АБК-зависимого стрессорного сигнала, целый ряд пробелов в отдельных стадиях прохождения сигнала по-прежнему ожидает заполнения. В частности, не в полной мере изучены механизмы регуляции активности белков ABF (ABRE Binding Factor), ключевых факторов транскрипции, регулирующих экспрессию генов в рамках АБК-зависимого пути передачи стрессорного сигнала. Так, например, недавно был установлен факт взаимодействия факторов транскрипции ABF ячменя с регуляторными белками 14-3-3. Однако, какова физиологическая роль такового взаимодействия для белков ABF и для процессов адаптации в целом, не вполне ясно. Принимая во внимание разнообразие изоформ 14-3-3 в различных растениях, встает вопрос о возможной специфичности их взаимодействий с факторами транскрипции ABF или же, наоборот, о том, какую роль может играть возможное многообразие вариантов взаимодействия белков 14-3-3 и ABF. Более того, остается неясным, какую роль для сигнальной трансдукции может играть многообразие изоформ 14-3-3 в разных видах растений. Слабая изученность данной области сигнальной трансдукции, а также важность понимания фундаментальных основ передачи стрессовых сигналов послужила причиной нашего интереса к изучению возможных механизмов взаимодействия белков 14-3-3 с факторами транскрипции ABF.
В качестве объекта исследований было использовано растение Thellungiella salsuginea, близкородственное Arabidopsis, но проявляющее большую устойчивость к таким факторам абиотического стресса, как высокие концентрации солей в почве и воздействие пониженных температур. Данное растение было принято научной общественностью в качестве нового модельного объекта для изучения механизмов устойчивости к абиотическому стрессу.
Перед выполнением работы была сформулирована следующая цель:
- выяснить, возможна ли посттрансляционная регуляция активности факторов транскрипции ABF на основе их взаимодействия с регуляторными белками 14-3-3, а также выяснить, есть ли какие либо отличительные особенности в структуре данных белков и экспрессии кодирующих их генов в растениях Thellungiella salsuginea.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
- идентифицировать в Thellungiella salsuginea гены факторов транскрипции ABF;
- охарактеризовать первичную структуру белков ABF из растений Thellungiella;
- охарактеризовать особенности экспрессии генов ABF из Thellungiella под влиянием высоких концентраций солей в питательной среде;
- идентифицировать гены, кодирующие разные изоформы белков 14-3-3 в растениях Thellungiella, и охарактеризовать их первичную структуру;
- охарактеризовать особенности экспрессии генов 14-3-3 в Thellungiella в нормальных условиях и в ответ на стрессовые воздействия;
- выяснить, возможно ли взаимодействие регуляторных белков 14-3-3 с факторами транскрипции ABF и если таковое взаимодействие имеет место, установить, какой мотив в аминокислотной последовательности белков ABF является сайтом связывания белками 14-3-3;
- охарактеризовать степень специфичности взаимодействий регуляторных белков 14-3-3 с факторами транскрипции ABF в Thellungiella.
Научная новизна. В данной работе впервые идентифицированы 4 гена, кодирующих факторы транскрипции ABF в растениях Thellungiella salsuginea. Также, впервые идентифицированы 9 генов, кодирующих разные изоформы регуляторных белков 14-3-3. Установлены полные последовательности кДНК идентифицированных генов. Выявлено, что экспрессия большинства из исследуемых генов возрастает в ответ на действие повышенных концентраций солей. Также обнаружено, что возрастание экспрессии генов, чья функция, по-видимому, связана с адаптацией растения к стрессовым воздействиям, происходит значительно быстрее в растениях Thellungiella в сравнении с модельным объектом Arabidopsis thaliana. Установлено, что большинство изоформ 14-3-3 взаимодействует с факторами транскрипции ABF, при этом такое взаимодействие носит специфичный характер. Выявлено, что мотив RRTLT/SGP белков ABF является критическим для данного взаимодействия.
Апробация работы. Результаты исследований представлены на VII и X молодежных научных конференциях «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеренарии» (2007, 2010), VI международном съезде общества физиологов растений России (2007), международном симпозиуме «Plant Abiotic Stress Tolerance» (2009), Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (2010).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов и объектов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 209 источников. Материалы диссертации изложены на 112 страницах машинописного текста, включая 8 таблиц и 30 рисунков.
белок регуляторный ген экспрессия
Объекты и методы исследований
Биологический материал. Использовали растения 4-х экотипов растений Thellungiella - Yakutsk, Saratov, Buriatia и Altai II, обладающих разной фенотипической реакцией в ответ на стрессовые воздействия. Необходимо отметить, что растения экотипа Saratov, обладающие морфологией, отличной от растений других экотипов, использованных в данной работе, принадлежат к отдельному виду Thellungiella botschantzevii, недавно охарактеризованному в литературе (German 2008). Экотипы же Yakutsk, Buriatia и Altai II, также как и наиболее часто использующиеся в исследовательских работах Shandong и Yukon, принадлежат к виду T. salsuginea.
Для проведения эксперимента по измерению экспрессии генов ABF и 14-3-3 в ответ на действие повышенных концентраций солей растения Arabidopsis и Thellungiella выращивали в водной культуре в климатической камере в Ѕ среде Хогланда. В возрасте 6 недель после прорастания и через 2 дня после очередной смены питательной среды растения подвергали воздействию повышенной концентрации NaCl в течение 1 суток. Для этого концентрация соли в течение 2-х часов была доведена до 200 mM посредством 4-х последовательных добавлений в среду 5M NaCl. Группы по 3 растения были собраны через 0(контроль), 2, 8 и 24 часа после доведения конечной концентрации соли в растворе до 200 mM. После сбора растения замораживали в жидком азоте и хранили в морозильной камере (-70єC) до выделения тотальной РНК.
Для проверки тканеспецифичности экспрессии различных изоформ 14-3-3 в Thellungiella семена экотипа Yakutsk высевали на смесь почвы с песком в соотношении 2:1 соответственно. В возрасте 9 недель, когда сформировалось достаточное количество незрелых стручков, отдельно собранные здоровые листья, корни, цветки, цветоножки и стручки замораживали в жидком азоте и хранили в морозильной камере.
Для измерения экспрессии генов 14-3-3 при воздействии пониженных температур (4єC), растения экотипа Yakutsk выращивали в почве. По достижении возраста 6 недель растения переносили в климатическую камеру при 16-часовом дне и выдерживали там при 4є C в течение 3, 6, 10, 24, 50 и 96 часов. В указанные временные точки группы из 4-х растений были собраны (корни и надземные части отдельно), заморожены в жидком азоте и помещены в морозильную камеру для хранения при -70єC. Растения контрольной группы, не подверженные действию пониженной температуры, были собраны в начале эксперимента. Опыт проводили в трехкратной повторности.
Выделение тотальной РНК из растений проводили с использованием реагента Trizol («Invitrogen», США) в соответствие рекомендациям фирмы-изготовителя. Все измерения проводили в трехкратной повторности.
Синтез кДНК, постановку ПЦР, клонирование генно-инженерных конструкций осуществляли согласно протоколам «Molecular cloning» (Sambrook and Russell, 2001).
Идентификация генов 14-3-3 и ABF в растениях Thellungiella. Фрагменты четырех предполагаемых изоформ 14-3-3, гомологичных изоформам Chi, Epsilon, Omega и Mu из Arabidopsis, были обнаружены в базе данных на сайте Национального центра биотехнологической информации (NCBI - http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Чтобы установить последовательности центральных фрагментов кДНК других пяти изоформ 14-3-3 из Thellungiella (Upsilon, Psi, Omicron, Phi and Lambda), были подобраны пары специфичных праймеров, основываясь на ожидаемой гомологии с аналогичными генами Arabidopsis. Для идентификации центральных фрагментов генов ABF использовали вырожденные праймеры. Полные последовательности кДНК, кодирующие разные изоформы 14-3-3 и ABF были установлены методами 3' и 5' RACE-PCR.
Измерение экспрессии генов ABF и 14-3-3 в растениях Arabidopsis и Thellungiella. Измерение экспрессии генов, кодирующих разные изоформы 14-3-3 и ABF, проводили с использованием олигонуклеотидов, специфичных для 3'-нетранслируемых областей отдельных генов. ОТ-ПЦР в реальном времени проводили на приборе Chromo 4™ (BioRad) в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I с использованием реакционной смеси, содержащей Hot Start Taq полимеразу. Для расчета результатов использовали [delta][delta]Ct метод. Амплификацию фрагмента гена актина использовали в качестве внутреннего стандарта. Для сравнения уровней экспрессии генов 14-3-3 в растениях Thellungiella и Arabidopsis проводили их калибровку по абсолютному количественному уровню экспрессии гена актина методом [delta]Ct.
Дрожжевой двугибридный анализ проводили для проверки возможного взаимодействия белков 14-3-3 с факторами транскрипции ABF. Для проведения анализа был использован штамм дрожжей PJ69-4A, а также экспрессионные векторы pBD-GAL4 Cam (Stratagene) и pGADT7 (Clontech). Кодирующие части восьми генов 14-3-3 из Thellungiella были амплифицированы и клонированы в вектор pBD-GAL4 Cam. Кодирующие части генов ABF2 и ABF4 были клонированы в вектор pGADT7. Кроме того, в pGADT7 вектор была клонирована кодирующая часть гена ABF2 с точечной мутацией в предполагаемом сайте связывания с белками 14-3-3, приводящей к замене серина в позиции 393 на аланин. Трансформацию дрожжей проводили стандартным методом с использованием ацетата лития (Gietz et al. 1992). Качественный анализ взаимодействия белков проводили на селективной среде SD, не содержащей лейцин, триптофан, гистидин и аденин (SD-LWHA). По активности в-галактозидазы оценивали интенсивность взаимодействия белков. Активность в-галактозидазы измеряли в единицах Миллера (Miller 1972)
Результаты и обсуждение
Идентификация генов ABF. С целью идентификации генов ABF в растениях Thellungiella нами были подобраны вырожденные праймеры, используя гены Arabidopsis в качестве основы в силу родства данных видов. В результате амплификации были получены 4 фрагмента ожидаемых размеров. Все фрагменты были клонированы в векторе pGEM-T. Установление нуклеотидной последовательности фрагментов подтвердило, что они кодируют центральные домены генов ABF в Thellungiella. Используя вновь установленные нуклеотидные последовательности, были подобраны изоформ-специфичные праймеры для проведения RACE-PCR. После амплификации 3'- и 5'-концевые фрагменты предполагаемых генов ABF Thellungiella были также клонированы в векторе pGEM-T и секвенированы. Идентифицированные гены были названы TsABF1-4 в соответствии с их гомологами из Arabidopsis. Гомология аминокислотных последовательностей TsABF1, TsABF2, TsABF3 и TsABF4 с таковыми из Arabidopsis составила 71, 77, 85 and 88%, соответственно.
Рис. 1. Выравнивание аминокислотных последовательностей идентифицированных изоформ ABF. А - Схематическое изображение расположения консервативных доменов факторов транскрипции ABF. Б - Выравнивание аминокислотных последовательностей идентифицированных изоформ. Аминокислотные остатки, выделенные черным цветом, являются идентичными. Выравнивание было проведено с использованием программы ClustalW.
Все идентифицированные гены были зарегистрированы в электронной базе данных GenBank на сайте NCBI под учетными номерами JQ971971, JQ971972, JQ971973 and JQ971974 (TsABF1-4, соответственно). Схематическая структура, отображающая консервативные домены, характерные для идентифицированных белков TsABF, приведена на рис. 1. Все изоформы идентифицированных белков из Thellungiella, как и их гомологи из Arabidopsis, содержат характерный для всех факторов транскрипции ABF bZIP Basic region/leucine zipper motif (основной домен/ лейциновая молния) домен с 4-мя повторами лейцина, составляющими лейциновую молнию, а также 3 консервативных (С1, С2 и С3) N-концевых домена и 1 консервативный (С4) C-концевой домен. При этом высокая степень консервативности данных доменов отмечена для разных видов растений. Основные отличия изоформ TsABF друг от друга и от их аналогов из Arabidopsis были характерны для междоменных областей. Наибольшие отличия от гомологичного белка из Arabidopsis наблюдались для TsABF1. Основываясь на наблюдении фенотипов тройных мутантов the abf2 abf3 abf4 по литературым данным белки ABF2, ABF3 и ABF4 были охарактеризованы как основные факторы транскрипции, регулирующие экспрессию генов под действием засоления и АБК (Yoshida et al. 2010). Возможно потому, что ABF1 играет менее важную роль в адаптивных процессах, для данного гена была характерна более высокая дивергенция в Thellungiella от общего с AtABF1 предка.