Гипоталамо-гипофизарная нейросекреторная система в условиях воспаления (экспериментально-морфологическое исследование)
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. На рубеже XX и XXI веков зародилась новая интегральная медико-биологическая дисциплина - нейроиммуноэндокринология, которая объединяет и координирует исследования, направленные на изучение механизмов взаимодействия основных регулирующих систем - нервной, эндокринной и иммунной (Акмаев И.Г., 1996, 1999; Basedovski et al, 1996).
В нейроиммуноэндокринную систему входят гипоталамо-гипофизарно-адреналовая система, гипоталамо-гипофизарная нейросекреторная система, а со стороны иммунной системы - комплекс цитокинов - сигнальных молекул, вырабатываемых клетками лимфоцитарного и моноцитарно-макрофагального ряда.
Единство регуляторных систем наиболее ярко проявляется при состояниях, угрожающих целостности и жизни организма, например воспалительной реакции. Цитокины, как главные медиаторы воспаления, оказывают разнообразные эффекты на нейроэндокринные нейроны гипоталамуса и клетки эндокринных желез, изменяя активность гормональных систем, которые, в свою очередь, компенсируют вызванные воспалением нарушения. Гипоталамо-гипофизарно-адреналовая система и ее конечный продукт - глюкокортикоиды являются главным биологическим инструментом адаптации организма к стрессу различной природы, в том числе и «иммунному».
Гипоталамо-гипофизарная нейросекреторная система, менее изученная система, состоит из крупноклеточных ядер гипоталамуса, нейроны которых синтезируют гормон вазопрессин. Значение системного вазопрессина при воспалении определяется, в первую очередь, его потенциальной возможностью компенсировать потери воды, обусловленные симптомами воспаления. На сегодняшний день описан широкий спектр эффектов антидиуретического гормона на метаболизм, температуру тела, поведение, сосудистый тонус, а также локальных - ауто\паракринных. (Murphy et al., 1993; Гриневич В.В., Поленов А.Л., 1994; Гриневич В.В. и др., 1997, 2003; Verbalis, 1999; Wang et al., 1998; Hurbin А et al, 2002).
Из всего многообразия этиологических факторов воспаления (бактерии, вирусы, простейшие) в настоящее время приобретает актуальность изучение влияния бактериального эндотоксина липополисахарида (ЛПС) на гипоталамо-гипофизарную нейросекреторную систему. ЛПС является одним из наиболее мощных бактериальных антигенов, приводящих к запуску воспалительной реакции через специфические рецепторы (CD14, TLR4) на макрофагах, дендритных клетках и др. (Medzitov, Janeway., 1997; Akira et al., 2001; von Meyenburg et al., 2004). При этом происходит усиление секреции и выброс различных медиаторов воспаления, изменяющих тканевой метаболизм, микроциркуляцию, активирующих Т- и В- лимфоциты, которые в свою очередь вырабатывают каскады цитокинов - интерлейкин-1 (ИЛ-1), интерлейкин-6 (ИЛ-6) и фактор некроза опухолей б (ФНО-б), осуществляющие межклеточную кооперацию при иммунном ответе. В работах как наших, так и зарубежных авторов показано на примере гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы, что ЛПС непосредственно не изменяет активности нейросекреторных клеток и клеток аденогипофиза, а является мощным индуктором синтеза ИЛ-1 - основного медиатора эффектов бактериального эндотоксина липополисахарида. (Гриневич В.В. и др., 1999; Акмаев И.Г., Гриневич В.В., 2003; Chrousos, 1995; Turnbull, Rivier., 1999).
Цель исследования: изучить морфофункциональное состояние гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы у крыс и факторы, регулирующие секрецию крупноклеточного вазопрессина, в условиях острого воспаления в эксперименте.
Задачи исследования:
1. Исследовать транскрипцию, трансляцию вазопрессина в крупноклеточных нейронах гипоталамуса и его секрецию в кровь у крыс после однократной внутрибрюшинной инъекции бактериального эндотоксина липополисахарида в низкой дозе (25 мкг\100г веса) и высокой дозе (250мг\100г веса) в динамике (0, 30мин, 3ч, 6ч).
2. Изучить эффект однократной внутрибрюшинной инъекции бактериального эндотоксина липополисахарида (250мг\100г веса) на экспрессию и секрецию крупноклеточного вазопрессина в условиях физиологической осмотической стимуляции.
3. Исследовать транскрипцию, трансляцию вазопрессина в крупноклеточных нейронах гипоталамуса и его секрецию у адреналэктомированных и ложнооперированных крыс после однократной инъекции бактериального эндотоксина липополисахарида в дозе 25 мкг\100г веса.
Научная новизна. В настоящем исследовании получены новые данные о морфофункциональной характеристике гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы у крыс в условиях острого воспаления (в эксперименте).
Проведена сравнительная оценка влияния однократного внутрибрюшинного введения низких и высоких доз липополисахарида (25мкг\100г и 250 мкг/100г) на синтез и секрецию крупноклеточного вазопрессина у крыс в базальных условиях, так и при физиологической осмотической стимуляции гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы с помощью морфологических, электронно-микроскопических, иммуноцитохимических методов исследования.
Используя метод авторадиографической гибридизации «in situ» выявлен новый «неосмотический» механизм регуляции крупноклеточного вазопрессин-ергического нейрона в условиях острого воспаления (липополисахарид, 250мкг\100г).
Получены достоверные данные об усилении синтеза и секреции крупноклеточного вазопрессина при однократном интраперитонеальном введении липополисахарида (25 мкг\100г) на фоне двусторонней адреналэктомии, что свидетельствует подавляющей роли глюкокортикоидов в регуляции крупноклеточного вазопрессин-синтезирующего нейрона гипоталамуса при воспалении.
Теоретическая и практическая значимость. Воспалительный процесс, имеющий глубокие эволюционные корни, неизменно привлекает специалистов в области биологии и медицины, как с точки зрения своей феноменологии, так и практического здравоохранения. Все исследования, проливающие свет на механизмы его реализации и понимания роли в этих механизмах взаимодействия основных регулирующих систем организма, представляются важными в своей концептуальной основе и значимыми для практической медицины, поскольку подводят теоретический базис к разработке новых диагностических критериев и терапевтических подходов к лечению и профилактике воспалительных процессов.
Внедрение в практику. В результате проведенного экспериментального исследования получены данные о морфофункциональной характеристике гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы в условиях острого воспаления (в эксперименте), которые используются в учебном процессе и научной работе кафедры гистологии и эмбриологии педиатрического факультета ГОУ ВПО РГМУ РосЗдрава РФ.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на:
1. Всероссийской конференции с международным участием «Нейроэндокринология-2003» 23-25 сентября 2003 г.-Санкт-Петергбург, Россия.
2. I Всероссийской конференции «Физиология иммунной системы» 11-14 октября 2003г, Сочи, Дагомыс.
3. Всероссийской научной конференции «Гистологическая наука России в начале XXI века: итоги, задачи, перспективы», Москва, 2003г.
4. 3-ем Российском Конгрессе по патофизиологии с международным участием, Москва, 9-12 ноября 2004г.
5. VII Всероссийской конференции по патологии клетки, Москва, 2005г.
6. Межкафедральном заседании сотрудников кафедр гистологии и эмбриологии педиатрического и лечебного факультетов ГОУ ВПО РГМУ РосЗдрава.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 1 статья - в журнале, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, состоит из введения, 8 глав, включающих обзор литературы и обсуждение полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя используемой литературы, включающего 71 отечественных и 144 зарубежных источников.
База проведения исследования. Кафедра гистологии и эмбриологии педиатрического факультета ГОУ ВПО РГМУ МЗ РФ, лаборатория электронной микроскопии ЦНИЛ ГОУ ВПО РГМУ МЗ РФ под рук. член-корр. РАМН, д.м.н., профессора Банина В.В., лаборатория гормонов и рецепторов под рук. д.б.н. П.М.Рубцова Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, Москва, Россия.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Все эксперименты проводились на крысах-самцах линии Wistar (n=97) весом 250-300г в начале эксперимента. Животные содержались по 2-3 в клетке, получали свободный доступ к воде и сухому корму. Световой день составлял 12 часов. Адаптация к условиям вивария (кафедра гистологии и эмбриологии педиатрического факультета ГОУ ВПО РГМУ МЗ РФ) проводилась 2 недели, в течение которых крыс приучали к рукам ухаживающего персонала. За день до проведения эксперимента животных взвешивали и рассчитывали дозировки бактериального эндотоксина липополисахарида.
1. Для оценки состояния гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы в условиях острого воспаления проводилась однократная внутрибрюшинная инъекция липополисахарида Во всех экспериментах мы использовали ЛПС, полученный из культуры Escherichia coli (Серотип 0111:В4, №L-3012, лот № 36Н4130, Sigma, США). Дозировка липополисахарида составляла 250мкг/100г веса животного. в дозе 250 мкг\100г (30 крыс), выводили животных из эксперимента через 30 мин (n=6), 1 ч (n=6), 3 ч (n=6), 6 ч (n=6), 12 ч (n=6) после инъекции. Крысы контрольной группы получали интраперитонеальную инъекцию стерильного физиологического раствора (300мкл).
2. Для изучения эффекта липополисахарида на активность гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы в условиях осмотической стимуляции животных разделили на 4 группы:
1) Контроль (n=5),
2) 1-я опытная группа (n=17) - однократное интраперитонеальное введение липополисахарида (250 мкг\100г),
3) 2-я опытная группа (n=6) - животных в течение 6 дней подвергались солевой нагрузке (для этого воду в поилках замещали 2% раствором NaCl),
4) 3-я опытная группа (n=14). Животных этой группы на седьмой день солевой нагрузки (2% раствор NaCl) через 3ч (n=7) и 6 ч (n=7) после внутрибрюшинной инъекции липополисахарида в дозе 250 мкг\100г веса выводили из эксперимента.
3. Эффект бактериального эндотоксина на активность гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы у адреналэктомированных крыс оценивался по материалам 3 групп животных:
1-я группа - контроль - (n=20) - животным однократно внутрибрюшинное вводили липополисахарид в дозе 25 мкг\100г веса, с последующим выведением их из эксперимента через 30 мин, 1ч, 3ч, 6ч. после инъекции.
2-я группа - (n=20) - животным этой группы произведена двухсторонняя адреналэктомия под комбинированным наркозом (эфир для наркоза, тиопентал натрия). После операции крысы получали 0,9% раствор NaCl для компенсации потерь натрия в отсутствии альдостерона.
3-я группа крыс - (n=20) животные подвергалась ложной операции, которая воспроизводила все этапы операционного стресса. Под комбинированным наркозом крысам производилось вскрытие забрюшинного пространства - животное располагается лежа на животе, производится послойный разрез в паравертебральной области чуть ниже реберной дуги с обеих сторон, затем разведение тканей в этой области с помощью кончиков сосудистого зажима, после чего накладывались послойные швы.
Через 2 недели после операции каждому животному 2-ой и 3-ей группы вводили липополисахарид (25мкг\100г) путем однократной внутрибрюшинной инъекцией, материал забирали через 30 мин, 1ч, 3ч, 6 ч после инъекции.
Кровь собирали, гепаринизировали, центрифугировали, собирали плазму и замораживали при -800С для определения уровней вазопрессина и натрия.
Для проведения авторадиографической гибридизации in situ мозг быстро извлекали из черепной коробки и целиком замораживались на сухом льду.
Гипофиз заливали в среду Tissue Teck (Sacura Finetek Inc.USA), полимеризующуюся при охлаждении (-20С), и замораживали на сухом льду. Затем на криостате изготавливали срезы толщиной 12 мкм, монтировали их на стекла, и хранили при -800С. Часть материала забирали для заливки в парафин (для иммунной гистохимии, ДАБ-глюкозооксидазный метод) и в эпон (для трансмиссионной электронной микроскопии).
Для оценки гибридизационных сигналов срезы экспонировались на высокочувствительной авторадиографической (рентгеновской) пленке BIOMAX MR (Kodak, IBI, New Heaven, CT, USA) с опытным выбором оптимального времени экспозиции для каждой из проб: 12ч для гнРНК и 15 мин мРНК.
После проявления пленки оптическая плотность сигнала определялась с помощью компьютеризированной системы анализа изображений (Imaging Research, St Catherine, Ontario, Canada), используя публичный домен программы анализа изображений Национального института Здоровья США (Интернет сайт: http://www.rsb.Info.nih.gov/nih-image). Оптическую плотность определяли как минимум на 2 последовательных срезах, вычисляли среднее значение для каждого животного, а потом - для всей группы.
Статистическая обработка проводилась с помощью комплексного пакета программ ANOVA, включающего тест Fisher'а (least significant difference procedure - PLSD). P<0.05 считалось статистически достоверной разницей между экспериментальными группами. Данные представлены в виде среднего и ошибки среднего. Плотность сигнала (уровни гнРНК и мРНК ВП) представлены в виде абсолютных единиц оптической плотности - пикселях.
Приготовление проб, гибридизации и анализ результатов проводились совместно с проф. В.В.Гриневичем в лаборатории гормонов и рецепторов под руководством д.б.н. П.М.Рубцова (Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, Москва, Россия).
Результаты собственных исследований и их обсуждение
Вазопрессин - один из древнейших нейрогормонов (А.Л.Поленов, 1968), выполняющий широкий спектр функций в организме животных и человека. Однако главной его функцией считается регуляция реабсорбции воды в собирательных трубочках почки. И именно эта направленность действия ВП становится особенно важной и достойной изучения в условиях, когда организм теряет воду. Наиболее частой причиной обезвоживания является системное воспаление. И чем оно тяжелее, тем более высока потеря воды.