Приведенная таблица имеет некоторое сходство с таблицей Мен делеева. В ней тоже есть незаполненные места. Так, например, до сих пор не известны дезоксивирусы со свойствами 2.2 (однонитчатая ДНК, спиральный тип симметрии) или рибовирусы со свойствами 1.2 (РНК двухнитчатая, смешанный тип симметрии). Может быть, таких виру
сов и нет в природе, а может, их еще не открыли. Совсем недавно ри
бовирусы со свойствами 1.1.1 не были известны, но затем оказалось, что к ним относятся реовирусы и сходные с ними вирусы раневых опу
холей растений. То же самое относится и к дезоксивирусам со свой
ствами 2.1.1.
На практике при классификации вирусов часто используются традиционные, исторические критерии. Так, одним из них являет
ся круг хозяев. По этому критерию выделяют вирусы грибов, прос
тейших, бактерий, растений и животных.
10
Глава 2
ТИПЫ ОРГАНИЗАЦИИ ВИРИОНОВ
Как указывали Лурия и Дарнелл (1970), исключительная осо бенность большинства вирусов состоит в их однородности по фор ме и величине. Они даже более однородны, чем покоящиеся споры бактерий. С помощью электронного микроскопа удалось показать, что эта однородность по форме и размерам сопряжена с подобной же однородностью организации белков, окружающих вирусную нуклеиновую кислоту. Несколько менее однородными являются вирусы, имеющие внешние липидосодержащие оболочки.
2.1. Структура вирионов
Структура вирусов являются наиболее продвинутым разделом фундаментальной вирусологии. Прорыву в данной области способ ствовала идея классиков биологии, Уотсона и Крика (J. Watson и F. Crick) о том, что простейшие вирусы должны быть построены из идентичных субъединиц и образовывать структуры, имеющие спи ральный, кубический или смешанный тип симметрии (табл. 1, рис. 2 и 3).
Вирусные частицы (вирионы) представляют собой белковую капсулу – капсид, содержащую геном вируса, представленный од ной или несколькими молекулами ДНК или РНК. Капсид постро ен из капсомеров – белковых комплексов, в свою очередь состоя щих из протомеров. Нуклеиновая кислота в комплексе с белком обозначается термином нуклеокапсид. Некоторые вирусы имеют также внешнюю липидную оболочку (рис. 4).
Размеры различных вирусов колеблются от 20 (пикорнавиру сы) до 750 (мимивирусы) и более нанометров. О разнообразии форм и размеров вирусов можно судить по рис. 5.
2.2. Физико%химические особенности
Изучение анатомии вирионов позволило получить много по лезной информации о химии и молекулярно биологических свой ствах элементарных вирусных компонентов. Иногда эти сведения позволяли понять предназначение, биологический (физиологи ческий) смысл образования тех или иных вирусных структур.
11
Химическая структура вирусов по элементарному составу не позволяет выделить какие либо специфические отличия их от дру гих биологических объектов. Описанные исключения (например, замена у Т четных фагов цитозина на 5 оксиметилцитозин) не на рушают общего правила. Главные выводы, которые можно сделать на основании изучения химической структуры, это то, что все ви, рионы – нуклеопротеиды и что вирусные геномы состоят только из одного типа нуклеиновой кислоты. Особенностью царства вирусов является наличие РНК геномов. Размеры вирусных геномов ми нимальны и одновременно достаточны для обеспечения необходи мых молекулярных механизмов репродукции вирусов. Следствием этого является важная особенность вирусных белков – они мини мизованы как по размерам, так и функциям. Молекулярные массы вирусных белков варьируют в относительно узких пределах (15– 50 кД), и большинство из них образовано 200–250 аминокислот ными остатками. Именно из таких небольших по размеру белков и формируются более крупные и сложные морфологические струк туры, в том числе крупные комплексные вирионы или гигантские внутриклеточные включения.
Полисахариды и липиды в составе вирионов и субвирусных структурах имеют клеточное происхождение, поскольку собствен ным, автономным арсеналом средств для гликозилирования бел ков или создания липопротеидных структур (мембран) вирусы не обладают.
Многие вирусные ферменты широко используются в биохимии и
молекулярной биологии (ревертаза вируса миелобластоза птиц, ней раминидаза вируса гриппа, тимидинкиназа вируса герпеса и т.п.).
Тропность вирусов к восприимчивым клеткам подразумевает способность вирионов распознавать такие клетки. Функцию рас познавания выполняют лиганды вирионов, способные стереоспе цифически взаимодействовать с соответствующими клеточными рецепторами. Высокоспециализированные лиганды описаны у бак териофагов. У вирусов животных (полиовирусы, миксо и парамик совирусы, ретровирусы) выявлены зоны, способные влиять на раз витие и течение вирусных инфекций (например, на интерференцию вирусов). Значение специфических взаимодействий вирусных ли гандов и клеточных рецепторов, обеспечивающих тропность вируса к определенному типу клеток, показано на примере вируса иммуно дефицита человека и рецепторов Т4 лимфоцитов CD4.
Вопросы взаимодействия вирусов с клетками растений и гри
бами рассматриваются в главе 8.
12
Глава 3
РЕПРОДУКЦИЯ ВИРУСОВ
Цикл размножения вирусов обычно подразделяют на 4 этапа.
1.Адсорбция и проникновение вирусов в клетки.
2.Депротеинизация вирионов («раздевание»).
3.Экспрессия вирусных геномов (транскрипция, трансляция; репликация вирусных геномов; транспорт вирусных белков и нук леиновых кислот в места сборки вирионов).
4.Сборка и выход вирионов из клетки.
1. Адсорбция и проникновение вирусов в клетки
Адсорбция начинается с «узнавания» вирусом восприимчивых клеток. Специфичность процесса определяется наличием рецеп торов на поверхности клеток и распознающих (комплементарных) группировок, экспонированных в структуре наружных оболочек вирионов. Число специфических рецепторов на поверхности клет ки составляет, например, для парвовирусов 105, для пикорнавиру сов – 104. Большинство клеточных рецепторов являются глико протеидами. Установлено, что клеточные липиды также выполня ют важные функции, даже если не вступают в непосредственное взаимодействие с вирусными лигандами. Так, вследствие адсорб ции происходят качественные изменения в липидном бислое кле точных мембран (например, резкое увеличение текучести), кото рые повышают эффективность следующего этапа – проникнове ние вирусов в клетки.
Проникновение вирусов в клетки осуществляется с использова нием двух механизмов. Основным из них является адсорбционный эндоцитоз – поглощение макромолекул, для которых на плазмо лемме имеются рецепторы. При этом жидкости и не связанные с рецепторами вещества почти не поглощаются. Везикулы, возника ющие при адсорбционном эндоцитозе, образуются в местах инва
гинаций плазмалеммы, покрытых с цитоплазматической стороны волокнистым материалом, мембранным белком клатрином. Ин тернализация вирусов происходит именно такими везикулами. Подобным образом в клетки поступает большинство безоболочеч ных («голых») вирусов и некоторые вирусы, покрытые оболочкой.
13
Второй механизм проникновения – виропексис, при котором вирион «прилипает» к цитоплазматической мембране, что позво ляет нуклеокапсиду в случае оболочечных вирусов или нуклеино вой кислоте безоболочечных вирусов непосредственно проникать в цитоплазму.
Все, о чем только что говорилось, в значительной мере отно сится к клеткам животных. В случае же растений и грибов, а также бактерий, обладающих ригидными клеточными стенками, меха низмы проникновения вирусов в клетки имеют свои особенности (см. главу 8).
2. «Раздевание» вирионов
Депротеинизация вирусных геномов – необходимый процесс для освобождения вирусной нуклеиновой кислоты из капсида в форме, пригодной для экспрессии генов. Вследствие событий, раз вертывающихся после проникновения вирусных геномов в цито плазму клеток, инфицирующие вирионы перестают существовать как организованные структуры.
Процессы «раздевания» осуществляются у разных вирусов по разному. В случае большинства бактериофагов и некоторых виру сов животных нуклеиновые кислоты впрыскиваются внутрь кле ток уже в депротеинизированном виде (оболочки или капсиды ос таются на поверхности клеток). Капсиды папова , парво , адено , герпесвирусов депротеинизируются клеточными протеазами еще до полного освобождения генома из белкового футляра. У поксви русов «раздевание» осуществляется в два этапа, причем на втором этапе для освобождения вирусной ДНК из сердцевины необходи мо участие вновь синтезированных в данной клетке продуктов ви русных генов. Наконец, реовирусы никогда не подвергаются пол ной депротеинизации и вирионная транскриптаза выполняет свои функции внутри вирусной сердцевины, которая структурно оста ется относительно интактной.
Как только вирусный геном освободился из белкового чехла, он может выполнять свои функции, действуя как матрица для трансляции, транскрипции генов и репликации вирусных гено
мов.
3. Экспрессия вирусных геномов
Репродукция ДНК вирусов за исключением поксвирусов про исходит в ядрах клеток, а репродукция РНК вирусов, исключая ортомиксо и ретровирусы, – в цитоплазме.
14
Стратегия репродукции вирусов определяется природой и осо бенностями строения их геномов (см. табл. 1). Тем не менее в процес се экспрессии генома любого вируса различают две стадии – «ран
нюю» и «позднюю». К первой относят синтез белков, которые участ вуют в транскрипции и репликации НК, а ко второй – синтез белков, необходимых для образования полноценных дочерних вирионов.
3.1. Транскрипция
Термином транскрипция обычно обозначают процессы синте за комплементарных геному РНК с информационными функция ми (иРНК) (рис. 6). Однако у (+)РНК геномных вирусов функции иРНК выполняет сам геном, который сразу же после инфицирова ния клеток начинает использовать рибосомы для синтеза вирус ных белков. При этом одним из первых образуется фермент РНК, зависимая РНК,полимераза, необходимая для образования новых молекул РНК. Следовательно, у (+)РНК геномных вирусов про цесса транскрипции как такового нет. То же имеет место в случае вирусов, геном которых состоит из комплементарных друг другу (+)РНК и ( )РНК; в качестве иРНК у двухнитевых РНК вирусов выступает (+)РНК нить.
Иначе обстоит дело у вирусов с ( )РНК геномом, который функциями иРНК не обладает («негативный РНК геном»). Поэто му требуется транскрипция ( )РНК для образования комплементар ной (+)РНК. Необходимую для этого РНК зависимую РНК поли меразу вирусы привносят в составе фрагментов своих капсидов [при заражении клеток ( )РНК геномные вирусы никогда полностью не раздеваются].
В случае вирусов с ДНК геномами транскрипция осуществля ется по классической схеме, а именно с помощью ДНК,зависимой РНК,полимеразы, которая отражает нуклеотидную последователь ность ДНК в нуклеотидной последовательности иРНК. Для этого часто используется фермент клетки хозяина.
Укажем также на феномен обратной транскрипции, т.е. на син тез ДНК на матрице РНК. Открытие обратной транскрипции вве ло поправку в центральную догму молекулярной биологии об од
нонаправленности движения генетической информации от ДНК к белку (ДНК→ РНК→ белок).
К вирусам, способным к обратной транскрипции, относятся некоторые возбудители злокачественных новообразований, а так же вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). Геном этих ретровиру, сов представлен однонитевой (+)РНК и кодирует, в частности,
15
фермент ревертазу, которая обладает свойствами как РНК зависи мой, так и ДНК зависимой ДНК полимеразы. Ревертаза тран скрибирует (+)РНК вирусов, копируя ее сначала в однонитевую ( )ДНК, а затем и двухнитевую ДНК (кДНК) (рис. 7). Важной осо бенностью этого транскрипта, т.е. кДНК, является его превраще ние в провирус, т.е. способность встраиваться в хромосому клетки. Интеграция вирусной ДНК (провируса) является уникальным со бытием в жизненном цикле ретровирусов и абсолютно необходима для их последующей репликации и персистенции в зараженных клетках. Специфические последовательности на концах LTR (так называемые att сайты), так же как и кодируемая вирусным геном pol интеграза, необходимы для процесса интеграции (рис. 8).
3.2. Трансляция
Трансляция – синтез белков, осуществляемый на рибосомах по программе, задаваемой молекулами информационных РНК (иРНК).
Механизмы трансляции принципиально одинаковы при син тезе клеточных и вирусных белков. Тем не менее имеются и неко торые важные особенности трансляции вирусных иРНК и ее регу ляции.
Поскольку геном вирусов кодирует несколько белков, то реа лизуется один из двух способов их экспрессии: либо транслируется гигантский полипептид предшественник, который затем специфи чески нарезается на функциональные белки; либо иРНК сразу транслируются с образованием дискретных вирусных белков. Син тез белков предшественников с их последующим нарезанием ха рактерен для (+)РНК вирусов, а синтез индивидуальных белков – для ( )РНК вирусов с фрагментированными геномами. Однако оба процесса часто переплетаются.
Вирусы, использующие клеточный аппарат трансляции, часто прибегают к подавлению синтеза клеточных белков. В таких случа ях синтез клеточных белков не происходит, а транслируются ви русные матрицы, находящиеся в гораздо меньших концентрациях.
3.3. Репликация
Термином репликация, или репродукция, обычно обозначают собственно процесс размножение вирусов. Как и при транскрип ции, механизм репликации зависит от типа геномной НК вирусов.
При репликации двухнитчатых ДНК вирусов матрицей для синтеза комплементарных дочерних цепей служит каждая из цепей
16
родительской ДНК. Для репликации геномных ДНК большинство вирусов использует клеточные ферменты репликативного комп лекса, в частности ДНК зависимые ДНК полимеразы. Однако не
которые вирусы, особенно крупные, кодируют собственные реп ликазы.
У(+)ДНК вирусов репликация начинается с синтеза компле ментарной ( )ДНК нити. Образовавшаяся двухспиральная репли, кативная форма (РФ), в свою очередь, выступает в роли матрицы для синтеза новых (+) цепей, которые затем вытесняются из РФ; они заключаются в белковую оболочку, превращаясь, таким обра зом, в вирионы (рис. 9). Принципиальное отличие в репликации однонитевых ДНК вирусов от репликации двухнитевых заключа ется в том, что в первом случае для образования дочерних молекул используется только ( ) цепь.
Процесс репликации однонитевых РНК вирусов, в общем, сходен с репликацией однонитевых ДНК вирусов. В начале реп ликации однонитевая родительская (+)РНК служит матрицей для синтеза дочерней ( )РНК и образуется двухспиральная РФ. Одна ко задолго до того, как закончится синтез первой дочерней РНК, на РФ инициируется синтез второй и последующих дочерних (+) нитей; в результате РФ превращается в новую форму, называемую
репликативным предшественником (РП), которая представляет со бой двойную спираль РНК и свисающие с нее «хвосты» (+)РНК. Эти «хвосты» вытесняются из РП вновь синтезируемыми молеку лами (+)РНК (рис. 10).
УРНК вирусов с двухцепочечным геномом матрицами для репликации служат только ( ) нити. Уже на ранних стадиях ин фекции в клетках накапливаются (+)РНК, одна часть которых ста новятся матрицами для репликации, а другая, как говорилось вы ше, используется в качестве иРНК.
Репликация ретровирусов происходит на матрице провирусов после их индукции. При этом с помощью клеточных ферментов син тезируются как многочисленные молекулы (+)РНК, так и необходи мые для сборки вирионов белки и ферменты.
3.4. Сборка и выход вирионов из клеток
В клетке биосинтез вирусных компонентов разобщен, протека ет в различных структурах ядра и цитоплазмы. Для сборки вирионов большое значение имеют механизмы внутриклеточного транспорта вирусных компонентов. Специфичность взаимодействия вирусных белков и нуклеиновых кислот обеспечивается как стереохимическим
17
соответствием взаимодействующих группировок, так и особыми ме ханизмами формирования вирионов в специализированных субкле точных структурах.
Распространенным способом формирования вирионов явля ется почкование. При этом белки наружных оболочек вирионов пенетрируют цитоплазматические мембраны таким образом, что формируют вирусоспецифический молекулярный слой на внеш ней поверхности клеточной мембраны, раздвигая собственно кле точные белки. К таким модифицированным участкам клеточных мембран переносятся другие вирусные компоненты (матриксный белок, нуклеокапсиды), которые распознают модифицированные участки клеточных мембран, взаимодействуют друг с другом и формируют специфические выпячивания. Такие выпячивания на заключительной стадии морфогенеза вирионов отшнуровываются от клеточной мембраны, не нарушая целостности клетки. Как правило, в процессе сборки происходит «дозревание» вирионов. Например, для вируса гриппа необходимым является внутриви рионный процессинг основного белка наружной оболочки – гем агглютинина. Происходит протеолитическое расщепление едино го полипептида на два фрагмента. При этом шесть N концевых аминокислотных остатков малой субъединицы гемагглютинина образуют специализированную группировку («шип»). Эта группи ровка вызывает прободение клеточной мембраны после адсорб ции вирионов на восприимчивых клетках и обеспечивает слияние наружной оболочки вирионов с клеточной мембраной. Если рас
щепления гемагглютинина не происходит, то вирионы становятся неинфекционными. Они распознают восприимчивые клетки, связываются со специфическими рецепторами, но не способны сливаться с цитоплазматическими мембранами и проникать внутрь клеток.
Выход вирионов из клеток может осуществляться различными способами, в том числе за счет лизиса клетки хозяина. В вирусоло гической лабораторной практике часто используются такие лити ческие экспериментальные системы. Они удобны для обнаружения вирусов, их титрования, иммунологических исследований. Однако в природе большинство вирусов предпочитает не убивать клетку хо зяина, а вступать с ней в более мягкие взаимоотношения, используя механизмы симбиотического характера. Почкование является од ним из примеров использования вирусами таких щадящих клетку механизмов.
3.5. Некоторые следствия избыточного синтеза белка
При репродукции вирусов в избытке образуются структурные, морфологические, единицы и субвирусные компоненты более вы
сокого порядка. В принципе все эти процессы хорошо сбалансиро ваны, но все же, пусть даже небольшие, дефекты в структуре белков (вследствие мутаций или рекомбинаций) всегда имеют место, что приводит к отбраковке измененных элементов. Отбраковка проис ходит на всех уровнях морфогенеза, вплоть до вирионов. Главным образом в результате этого в популяцию морфологически полно ценных вирионов включается только 0,1–1,0 % синтезированного в клетке вирусного белка. Остальная масса избыточно синтезирован ного белка выводится из клеток или идет на образование дефектных капсидов и вирионов, которым присущ ряд функций. В частности, одной из них является интерференция – запрет на проникновение в зараженные клетки других вирусов. Другая же функция – захват де фектными капсидами фрагментов клеточных нуклеиновых кислот и перенос их в другие клетки (как в случае общей трансдукции, см. раздел 8.6).
В зараженных клетках вирусы часто накапливают дефектные капсиды или структурированные поверхностные белки (HBsAg, «розетки» из поверхностных белков и т.п.). Клеточные включения, которые обнаруживаются в световом микроскопе и имеют диаг ностическое значение при некоторых заболеваниях (например, тельца Бабеша–Негри при бешенстве), являются продуктами того же избыточного синтеза (и внутриклеточного складирования) суб вирусных структур.
18 |
19 |