Эффективность процесса очистки воды от фенола биофильтром проточного типа оценивали по уравнению:
а = [(C - C) / C0] x 100%,(1)
где С0 и С - концентрации фенола в воде до (300 мг/л) и после обработки.
Концентрацию фенола определяли фотоколориметрическим методом, основанным на образовании окрашенных соединений фенола с 4-аминоантипирином в присутствии гексацианоферрата (III) при рН = 10,0 ± 0,2 [7].
Проводили три серии испытаний, n=3. Достоверность различий между средними значениями остаточной концентрации фенола в воде определяли по критерию Стьюдента на уровне значимости не менее 95% (р < 0,05). Обработку данных осуществляли с использованием программы «Microsoft Office Exњl 2003».
Результаты и их обсуждение
В результате исследований установлено, что на различных носителях биоплёнка образуется в разных объемах. Сравнительный анализ показал, что на песке и синтетическом носителе типа «ВИЯ» [16] иммобилизация бактерий-деструкторов фенола A. ichthiosmia ONU552, В. subtilis ONU551, P. maltophilia ONU329, P. fluorescens ONU328, P. cepacia ONU327 была слабовыраженной, биопленка не формировалась.
Наиболее активное образование биоплёнки отмечалось на створках мидий, торфе и керамических трубках. На керамических трубках, входящих в состав комплексной загрузки действующего биореактора, формировался сплошной слой развитой биопленки ассоциации бактерий (рис. 1).
В процессе 10-дневного использования биофильтра для очистки воды от фенола адгезия бактерий и образование поливидовой биопленки регистрировалось также на торфе, цеолите и активированном угле.
Образование поливидовой бактериальной биопленки на носителях в биофильтре способствовало повышению эффективности его работы на протяжении длительного времени (2 мес.) без дополнительной регенерации и повторной инокуляции бактериями-деструкторами комплексной загрузки (рис. 2). Сохранение видового разнообразия использованной ассоциации штаммов микроорганизмов-деструкторов фенола на заключительной стадии работы биофильтра подтверждено высевом на агаризованную среду по мор- фологическим-культуральным и биохимическим признакам. Численность каждого из штаммов по окончании работы биофильтра достигала порядка 5x104 кл/г сорбента.
Рис. 1. Биопленка ассоциации бактерий - деструкторов фенола на керамических трубках до и после инокуляции загрузки биофильтра. Окраска акридиновым оранжевым, увеличение 10x40
Fig. 1. Biofilm of bacteria - the destructors of phenol on the ceramic tubes before and after inoculation of the biofilter. Coloring with acridine orange, the increase of 10x40
В лабораторных условиях исследована эффективность работы колоночного биофильтра периодического действия проточно-восходящего типа с послойной модифицированной комплексной загрузкой при очистке фенол-со- держащей воды (исходная концентрация фенола 300 мг/л).
Через 2 часа работы биофильтра со скоростью 10 мл/мин степень очистки воды от фенола в динамическом режиме составляла 40% (остаточная концентрация фенола в воде 180±17,2 мг/л), что было связано с сорбцией фенола на носителях (рис. 2, A). Через сутки работы биофильтра в стационарно-циклическом режиме степень очистки воды повышалась до 67% (остаточная концентрация фенола в воде - 100±8,5 мг/л), а на 6-ой день достигала максимального значения - 90% (остаточная концентрация фенола в воде - 29,5±2,8 мг/л) (рис. 2, Б).
В последующие дни эффективность работы биофильтра в динамическом режиме при непрерывном поступлении загрязненной фенолом воды была на уровне 50-75%, а в стационарно-циклическом режиме достигала 80-90%, концентрация фенола в воде варьировала от 29,5±2,8 мг/л до 60±5,7 мг/л (рис. 2, Б).
Полученные данные свидетельствуют о том, что основной механизм удаления фенола из загрязненной воды - это биодеградация его иммобилизованными микроорганизмами (A. ichthiosmia ONU552, В. subtilis ONU551, P maltophilia ONU329, P. fluorescens ONU328, P cepacia ONU327).
Методом флуоресцентной микроскопии с использованием красителя акридинового оранжевого подтверждено, что используемые в опытах бактерии-деструкторы фенола образовывали биопленку на носителях разной природы.
На первом этапе происходила адгезия вегетативных форм бактерий, в последующем - формирование межклеточного матрикса биопленок. Можно полагать, что в период времени между 0,5 и 6 ч в биопленочной культуре происходил переход стадии адгезии клеток к началу формирования внеклеточного матрикса биопленки. При использовании керамических трубок в виде колец, торфяных волокнистых структур биопленка, заполнившая петлеобразные структуры загрузки увеличивает ее рабочую поверхность, приобретает двухсторонний контакт с очищаемой водой, что увеличивает эффективность очистки воды от фенола.
Рис. 2. Степень очистки фенол-содержащей воды в фильтре с иммобилизованными бактериями - деструкторами (1); нативными сорбентами (2) Примечание: исходная концентрация фенола в воде - 300 мг/л
Fig. 2. The degree of purification of phenol-containing water in the filter with immobilized bacteria - destructors (1); native sorbents (2)
Note: the initial concentration of phenol in water is 300 mg / l
Результаты наших исследований согласуются с данными работы [4], авторы которой наблюдали рост микроорганизмов на порошково-волокнистой загрузке биофильтра. Ими также проведено исследование модифицированной загрузки биофильтра для интенсификации очистки локальных сточных вод и показано, что в петлеобразных структурах загрузки бактериальная пленка образует мостики, что говорит о направленном росте сообщества микроорганизмов, формирующих матрикс к противоположной стороне петли. Такое распределение бактерий в матриксе биопленки на полимерном петлеобразном материале, способствует синтезу РНК, и, следовательно, ведет к повышению метаболизма биопленки в целом.
Таким образом, микробный консорциум (A. ichthiosmia ONU552, В. subtilis ONU551, P. maltophilia ONU329, P fluorescens ONU328, P. cepacia ONU327) образует на природных и синтетических носителях фильтра биопленку, что способствует повышению эффективности очистки воды от фенола (75-90%) и увеличению продолжительности работы биофильтра проточного типа (до 2 мес) без дополнительной регенерации.
Методом флуоресцентной микроскопии с использованием красителя акридинового оранжевого подтверждено, что используемые в опытах бактерии (A. ichthiosmia ONU552, В. subtilis ONU551, P. maltophilia ONU329, P fluorescens ONU328, P cepacia ONU327) - деструкторы фенола образовывали биопленки на носителях разной природы.
В лабораторных условиях подтверждена эффективность работы колоночного биофильтра периодического действия проточно-восходящего типа с послойной модифицированной комплексной загрузкой при очистке фенол-со- держащей воды (исходная концентрация фенола - 300 мг/л). Через 2 часа работы биофильтра степень очистки воды от фенола составляла 40% (остаточная концентрация фенола в воде 180±17,2 мг/л), через сутки - 67% (кон- цетрация фенола в воде - 100±8,5 мг/л) и достигала максимального значения 90% (концентрация фенола в воде 29,5±2,8 мг/л) на 6-ой день очистки.
Ассоциация бактерий A. ichthiosmia ONU552, В. subtilis ONU551, P maltophilia ONU329, P fluorescens ONU328, P. cepacia ONU327 может быть использована для очистки фенол-содержащих сточных вод в биофильтре.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
фенол загрязнитель очистка биопленка
1. Биопленки: основные методы исследования: учебно-методическое пособие / Марданова А.М. с соавт. - Казань: К(П)ФУ, 2016. - 42 с.
2. Ерохин П. С., Кузнецов О. С., КонновН. П., ВидяеваН. А., Уткин Д. В. Комплексный подход к изучению биопленок микроорганизмов методом атомно-силовой микроскопии // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия: Физика. - 2012. - Т. 12, № 1. - С. 42-46.
3. Павлова И. Б., Толмачева Г. М., Ленченко Е. М. Экспериментальное исследование процессов формирования биопленок Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus (световая и сканирующая электронная микроскопия) // Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии. - 2016. - №4(20). -С.65-73
4. Пукемо М. М., Симаков Ю. Г., Алексеев Е. В. Фрактальный рост микроорганизмов на порошково-волокнистой загрузке биофильтра и интенсификацию очистки сточных вод // Инновации и инвестиции. - 2015. - № 6.С. 181-185.
5. Серебренникова М. К. Биодеградация нефтяных углеводородов иммобилизованными родококками в колоночном биореакторе .. .Автореф. дис. канд. биол. наук: 03.02.03 - микробиология, Пермь - 2014. - 23 с.
6. Соколова Т. Н. Микробные биопленки и способы их обнаружения // Журнал Гродненского государственного медицинского университета. - 2014.№ 4. - С. 12-15.
7. Фомин Г. С. Вода. Контроль химической, бактериологической и радиационной безопасности по международным стандартам: Энциклопедический справочник. 3-изд. М., 2000. - 839 с.
8. Часова Э. В., Ивчук В. В. Эколого-химические характеристики и методы защиты окружающей среды от фенола // Вестник Криворожского национального университета. - 2013. - № 34(1). - С. 209-213.
9. Aromatic hydrocarbons removal by immobilized bacteria (Pseudomonas sp., Staphylococcus sp.) in fluidized bed bioreactor / J. Taoufok [et al] // Annals of Microbiology. - 2004. - Vol. 54, № 2. - P. 189-200.
10. Biodegradation of phenol in synthetic and industrial wastewater by Rhodococcus erythropolis UPV-1 immobilized in an air-stirred reactor with clarifier / M.B. Prieto [et al] // Applied Microbiology and Biotechnology. - 2002a. - Vol. 58, № 6. - P 853-859.
11. Camargo A. C. Biofilm formation on catheters used after cesarean section as observed by scanning electron microscopy / A.C. Camargo, E.L. Pizzolitto // International J. of Gynecology and Obstetrics. - 2005. Vol. 90. - P. 148-149.
12. Degradation of phenol by Rhodococcus erythropolis UPV-1 immobilized on Biolite in packed-bed reactor / M.B. Prieto [et al] // Journal of Biotechnology. - 2002b. - Vol. 97, № 1. - P. 1-11.
13. Gudzenko Tatyana, Wolodymyr Iwanycja, Olga Woljuwacz, Boris Galkin, Olga Zuk, Elena Gorszkowa. Biodegradacja fenoli i nnych cyklicznych zwi^z- kow aromatycznych. - Publisher: GlobeEdit is a trademark of International Book Market Service Ltd., member of OmniScriptum Publishing Group, 17 Meldrum Street, Beau Bassin 71504, Mauritius. (ISBN: 978-613-8-25347-1). - 2018. - 85 p.
14. Nor Suhaila Yaacob, Rosfarizan Mohamad, Siti Aqlima Ahmad. The influence of different modes of bioreactor operation on the efficiency of phenol degradation by Rhodococcus UKMP-5M // Rendiconti Lincei. - 2016. - 27(4). - P. 749-760.
15. Songwen Tan, Xuncai Chen, Chunzhi Cui, Yang Hou, Weiguo Li, Hong You. Biodegradation of saline phenolic wastewater in a biological contact oxidation reactor with immobilized cells of Oceanimonas sp.//Biotechnology Letters - 2017. - Vol. 39, Issue 1, P. 91-96.
16. Патент України №97747. Спосіб аеробного біологічного очищення стічних вод/ Гвоздяк П.І., Глоба Л.І., Саблій Л.А., Капарник А.І., Борисенко О.О., Жукова В.С. Опубл. 12.03.2012, Бюл. №5.
References
1. Bioplenki: Biofilms: basic research methods: teaching aid / Mardanova AM. s soavt. Kazan': K(P)FU, 2016: 42 [in Russian].
2. Erohin PS, Kuznecov OS, Konnov NP, Vidjaeva NA, Utkin DV An integrated approach to the study of microbial biofilms by atomic force microscopy. Izvestija Saratovskogo universiteta. Novaja serija. Serija: Fizika. 2012;12(1):42- 46 [in Russian].
3. Pavlova IB, Tolmacheva GM, Lenchenko EM. Experimental study of the formation of biofilms Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus (light and scanning electron microscopy). Problemy veterinarnoj sanitarii, gigieny i jekologii. 2016;4(20):65-73 [in Russian].
4. Pukemo MM, Simakov JuG, Alekseev EV. Fractal growth of microorganisms on the powder-fiber loading of the biofilter and intensification of wastewater treatment Innovacii i investicii. 2015;6:181-185 [in Russian].
5. Cerebrennikova MK. Biodegradation of petroleum hydrocarbons by immobilized rhodococci in a column bioreactor. Avtoref. dis. kand. biol. nauk: 03.02.03 - mikrobiologija, Perm' 2014:23. [in Russian].
6. Sokolova TN. Microbial biofilms and methods for their detection Zhurnal Grodnenskogo gosudarstvennogo medicinskogo universiteta. 2014;4:12-15. [in Russian].
7. Fomin GS. Voda. Kontrol' himicheskoj, bakteriologicheskoj i radiacionnoj bezopasnosti po mezhdunarodnym standartam: Jenciklopedicheskij spravochnik. 3-izd. M., 2000:839. [in Russian].
8. Chasova JeV, Ivchuk VV Ecological and chemical characteristics and methods of environmental protection from phenol. Vestnik Krivorozhskogo nacional'nogo universiteta. 2013;34(1):209-213. [in Russian].
9. Aromatic hydrocarbons removal by immobilized bacteria (Pseudomonas sp., Staphylococcus sp.) in fluidized bed bioreactor / J. Taoufok [et al]. Annals of Microbiology. 2004;54(2):189-200.
10. Biodegradation of phenol in synthetic and industrial wastewater by Rhodococcus erythropolis UPV-1 immobilized in an air-stirred reactor with clarifier / MB. Prieto [et al]. Applied Microbiology and Biotechnology. 2002a;58(6):853- 859.
11. Camargo AC, Pizzolitto EL. Biofilm formation on catheters used after cesarean section as observed by scanning electron microscopy. International J. of Gynecology and Obstetrics. 2005;90:148-149.
12. Degradation of phenol by Rhodococcus erythropolis UPV-1 immobilized on Biolite in packed-bed reactor / MB. Prieto [et al]. Journal of Biotechnology. 2002b;97(1):1-11.
13. Gudzenko Tatyana, Wolodymyr Iwanycja, Olga Woljuwacz, Boris Galkin, Olga Zuk, Elena Gorszkowa. Biodegradacja fenoli i nnych cyklicznych zwi^zkow aromatycznych. - Publisher: GlobeEdit is a trademark of International Book Market Service Ltd., member of OmniScriptum Publishing Group, 17 Meldrum Street, Beau Bassin 71504, Mauritius. 2018:85.
14. Nor Suhaila Yaacob, Rosfarizan Mohamad, Siti Aqlima Ahmad . The influence of different modes of bioreactor operation on the efficiency of phenol degradation by Rhodococcus UKMP-5M. Rendiconti Lincei. 2016;27(4):749-760.
15. Songwen Tan, Xuncai Chen, Chunzhi Cui, Yang Hou, Weiguo Li, Hong You. Biodegradation of saline phenolic wastewater in a biological contact oxidation reactor with immobilized cells of Oceanimonas sp. Biotechnology Letters. 2017;39(1):91-96.
16. Patent of Ukrai'ny №97747. Method of aerobic biological treatment of sewage / Gvozdyak PI, Globa LI, Sablij LA, Kaparnyk AI, Borysenko OO, Zhukova VS. Opubl. 12.03.2012. Byul. № 5 [in Ukrainian].