МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Методика воспроизведения моделированного дефекта у подопытных животных. В качестве модели, нарушения целостности кости, у наркотизированных подопытных животных создавали стандартный дефект, заключающийся в воспроизведении отверстий диаметром 0,5 см в области внутренней поверхности бедра на границе средней верхней ее трети.
В варианте замещения дефекта аутотрансплантатом на отмеченном сегменте бедренной кости сперва вырезали на всю толщину компактного слоя пластинку диаметром 0,5 см, а затем она, как трансплантат, обратно вставлялась на свое место и фиксировалась.
Введение антиоксидантов. В эксперименте вначале изучалось действие антиоксидантов при раздельном введении их, а затем при комплексном. Из антиоксидантов -токоферол ацетат в дозе 22мг/кг, ОП6 -18, фенозан калия - 26 мг/кг вводили ежедневно внутримышечно, селенцистеин вводился в дозе 2 мг/кг также внутримышечно но через день. В эксперименте СОД животным давали peros в дозе1500 Маккорд единиц ежедневно. Антиоксиданты подопытным животным вводились в течение 25 дней.
В клинике для коррекции интенсивности ПОЛ больным вводились - токоферолацетат в дозе 600 мг в сутки через день, аскорбиновая кислота в дозе 400 мг в сутки ежедневно внутримышечно в течение 25 дней.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Определение продуктов ПОЛ. Как указывалось выше, для оценки интенсивности ПОЛ в исследуемых тканях проводили определение содержания диеновых коньюгатов, гидроперекисей и малонового диальдегида.
Для обнаружения продуктов диеновых коньюгатов (ДК) проводили спектрофотометрическую регистрацию УФ поглощения растворов липидов, в 3-х мл смеси метанолгептана. Оптическую плотность регистрировали при 232нм.
Содержание гидроперекисей и малонил диальдегида (МДА) в пробах определяли по методу Asakawa, Matsushita (1980). Активность фермента супероксиддисмутазы определяли по методу, приведенному в работе Михеевича (1994), активность глутатионпероксидазы - по методике Рagliya, Valentine, антирадикальную активность тканей - методом Glevind'a (1963) с использованием стабильного свободного радикала -дифенил--пикрилгидрозила (ДФПГ). Содержание токоферолов определялось по методу de Lumen (1978).
Регистрация остеоденситограммы. В нашей работе для измерения плотности (массы) зоны дефекта и аутотрансплантата, замещающего дефект, использовали двуэнергетический рентгеновский абсорбционный денситометр “HOLOGIC Discover”. Участок измерения денситометрии был выбран в виде субрегиона дефекта, замещенного аутотрансплантатом. Для оценки результатов денситометрии использовали следующий критерий: минеральное содержание кости - bonemineral content (ВМС), выраженное в граммах в поперечном срезе кости, костная минеральная плотность -bonemineral dencity (ВМD), выраженная в граммах на единицу площади (area - грамм/см2).
Гистологическое исследование.Из декальцинированного материала бедренной кости на всех сериях опыта были взяты кусочки из следующих зон: зона стыка краев аутотрансплантата с краями дефекта, зона аутотрансплантата, зона регенератов моделированного дефекта без замещения. Микротомные срезы окрашивались гемотоксилином-эозином, пикрофуксином по ван Гизону, смесью тионина-пикриновой кислоты и уранином - для определения темпов и характера репарации в различных участках и зонах; метиловым зеленым-пиронином - для оценки интенсивности синтеза и содержания рибонуклеотидов.
Статистическая обработка полученных результатов. Статистическую обработку полученных данных проводили с применением интегрированного пакета прикладных программ “Statistica 6” для Windows. Определение достоверности различий средних значений проводилось с помощью t критерия Стьюдента и U критерия Уилкокосона-Манна-Уитни. Достоверными считали различие при p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Общие закономерности изменений интенсивности перекисного окисления липидов тканей при дефектах костей
Кинетика накопления продуктов ПОЛ в тканях у экспериментальных животных при моделированном дефекте костей.
Моделированный дефект бедренной кости у экспериментальных животных вызывал заметное усиление интенсивности ПОЛ в исследуемых тканях, о чем свидетельствовало накопление ДК, ГП и МДА в надкостнице, костном мозге, крови и печени. Содержание диеновых коньюгатов после моделированного дефекта в надкостнице через две недели увеличивалось с 0,150 до 0,450 Д232/мг липида без замещения, а с замещением до 0,760; в костном мозге без замещения содержание ДК через две недели с 0,095 увеличивалось до 0,320, с замещением до 0,410 Д232/мг липида.
Моделированный дефект бедренной кости в исследуемых тканях приводил к заметному усилению образования ГП. В надкостнице содержание ГП при моделированном дефекте без замещения в максимуме увеличивалось в 4,4 раза, в костном мозге - в 7,6 раза; в печени - в 2 раза; в крови - в 2,8 раза (рис. 1).
Рис. 1. Изменение содержания ГП в надкостнице у кроликов при моделированном дефекте бедренной кости:
1 - содержание ГП в интактной надкостнице; 2 - содержание ГП в надкостнице при моделированном дефекте костей без замещения; 3 - содержание ГП в надкостнице при моделированном дефекте костей замещенного аутотрансплантатом
Установлено, что моделированный дефект кости приводил и к увеличению содержания МДА в исследуемых тканях. Характер накопления МДА, выявленный в опытах с моделированным дефектом идентичен тому, что наблюдался при изучении накопления ГП.
Изменение антиоксилительной активности тканей при моделированном дефекте костей у экспериментальных животных.
При моделированном дефекте бедренной кости снижалась активность антиокислительных ферментов. Активность СОД в надкостнице в случае без замещения в течение 2-х недель уменьшалась с 280 до 92 мкг/г ткани, при замещении до 62 мкг/г ткани. В костном мозге активность СОД при этом в течение двух недель без замещения уменьшалась с 400 до 180, с замещением до 128 мкг/г ткани.
В надкостнице на фоне моделированного дефекта величина активности ГПО за 2 недели без замещения уменьшалась с 65 до 22,8, в случае замещения до 16 нмоль НАДФ/мг белка/мин. При моделированном дефекте костей активность СОД и ГПО в крови и печени изменялась по такой же закономерности как в надкостнице и в костном мозге.
Моделированный дефект вызывал снижение содержания токоферолов в тканях. В случае без замещения дефекта содержание их в течение 3-х недель в надкостнице уменьшалось до 10 мкг/г, в костном мозге до 20, в крови - 18, в печени - 21 мкг/г, а при замещении дефекта аутотрансплантатом в надкостнице уменьшалось от 21 до 6,5 мкг/г, в костном мозге от 33 до 13, в крови с 26 до 16, в печени от 35 до 16 мкг/г. После воспроизведения дефекта величина АРА также в исследуемых тканях значительно уменьшалась.
В случае без замещения дефекта, по сравнению с исходной величиной АРА, в надкостнице за 4 недели уменьшилась в 1,5; в костном мозге - 1,4; в крови - 1,8; в печени - 2,0 раза. При замещении дефекта она в исследуемых тканях уменьшалось в следующих пределах: в надкостнице от 8,4 до 3,8; в костном мозге от 15,1 до 8,6; в крови от 11 до 4,7; в печени от 13 до 6,1 мкмоль/мкэкв.
Изучение особенностей изменений интенсивности перекисного окисления липидов и антиокислительной активности крови у больных при дефектах, образовавшихся после резекции опухолей и опухолеподобных образований костей.
Клиника, диагностика и лечение больных доброкачественными опухолями и дисплазиями костей
Следующим этапом нашего исследования было определение закономерности развития процесса ПОЛ и факторов его регуляции в крови больных после удаления ДО и ДПК
Решение этого вопроса было неразрывно связано с установлением точного диагноза у обследованных больных, распределением их по различным нозологическим формам ДО и ДПК; проведением хирургического лечения больных, входящих в различные нозологические группы ДО и ДПК.
Исследования показали, что из различных нозологических форм ДО и ДПК остеобластокластома (ОБК) выявлена у 41 больных; остеома у 3; остеоидная остеома у 6, хондрома у 13; хондробластома у 5; костно-хрящевой экзостоз у 39; костная киста у 29; дисхондроплазия у 6; фибродисплазия у 14.
У обследованных больных наиболее часто встречались ОБК (26,3%), костно-хрящевой экзостоз (КХЭ) (25%), костная киста (18,5%), хондрома (8,4%), фибродисплазия (8,6%). ДО и ДПК наиболее часто поражались преимущественно длинные трубчатые кости и при этом чаще кости нижней конечности. В отличие от ОБК и КХЭ костная киста чаще наблюдалась на плечевой кости.
Из статистики различных нозологических форм ДО и ДПК следовало, что из обследованных больных у женщин ОБК, хондрома, хондробластома встречались чаще, чем у мужчин, остеоидная остеома, костно-хрящевой экзостоз, костная киста среди мужчин чаще, чем у женщин. Остеома, остеоидная остеома, хондрома, хондробластома, костная киста и костно-хрящевой экзостоз наиболее часто развивались в возрастной группе до 12-30 лет, дисхондроплазия, фибродисплазия у детей до 15 лет.
Рентгенологические исследования показали, что для больных с ОБК было характерно резкое истончение и ячеистая форма кортикального слоя и развитие опухоли в эпиметафизарном конце длинных трубчатых костей.
Осмотр макропрепарата, удаленного из опухоли больных с ОБК показал, что опухолевая ткань красновато-бурого, реже коричнево-белесоватого цвета, твердой или мягкой консистенции.
Гистологические исследования опухоли ОБК характеризовались наличием большого количества клеток овальной формы с укрупненными гиперхромными ядрами, нередко пронизанных множеством многоядерных симбластов.
Из рентгенограммы больных с КХЭ видно, что он, в основном, развивался из кортикального слоя в виде конуса, локализовался либо в метафизах, либо в эпифизарной пластинке трубчатых костей.
При гистологическом исследовании КХЭ на поверхности опухолеподобных образований имелся толстый хрящевой слой и гиалиновый хрящ с активным ростом на внутренней стороне, губчатая кость и краевая пластинка переходили в гиалиновый хрящ с гиперплазией хрящевых клеток.
На рентгеновских снимках у больных костной кистой хорошо видна резорбция костей, веретенообразное вздутие и истончение кортикального слоя, деструкция костно-мозговой части кортикального слоя и лизис губчатого вещества. В костных образцах, удаленных из кист микроскопически было установлено, что губчатая кость подверглась перестройке, уплотнению фиброзными костно- мозговыми клетками.
Содержимое костной кисты кровянистая или белесоватого цвета жидкость в которой микроскопически не обнаруживались кистозные элементы.
Обычным местом локализации костных кист являются метафизы длинных трубчатых костей.
Из рентгенограммы видно, что при фибродисплазии опухоль локализуется в метафизе и диафизе, пораженные костные трабекулы замещаются фиброзной и остеоидной тканью.
Осмотр макропрепаратов больных с фибродисплазией показывает, что удаленный из нее материал имеет хрящевую природу, образованную из фиброзной ткани и новообразованных костных трабекул.
Лечение больных с различными нозологическими формами ДО и ДПК проводилось оперативным вмешательством
В зависимости от места локализации, опухолевая ткань иссекалась краевой, внутриочаговой и сегментарной резекцией. В ряде случаев у одних и тех же больных проводили краевую и внутриочаговую резекцию. После иссечения опухоли и опухолеподобных образований для замещения дефекта использовали аутотрансплантат, деминерализованные костные матриксы или наложение аппарата Илизарова.
Нередко биохимические и биофизические процессы на месте дефекта создают неблагоприятный фон для консолидации фрагментов и репаративной регенерации. Согласно литературе, одним из таких процессов может быть усиление ПОЛ и накопление его токсических продуктов.
Кинетика накопления продуктов перекисного окисления липидов в крови больных при пострезекционных дефектах доброкачественных опухолей и опухолеподобных образований костей
Установлено, что у больных после удаления ДО и ДПК заметно усиливалась интенсивность ПОЛ в крови, о чем свидетельствовало резкое накопление гидроперекисей (ГП) и МДА. У больных в случае без замещения дефекта, образовавшегося после удаления ОБК костей, увеличение содержания ГП в крови через неделю достигало первого максимума, равного 12 нмоль/мг липида, и через 5 недель доходило до второго максимума при значении 6,2 нмоль/мг липида. При замещении дефекта аутотрансплантатом содержание ГП через одну неделю устанавливалось при значении 15 нмоль/мг липида, а 5 недель при значении 18,4 нмоль/мг липида.
После удаления ОБК изменение содержания МДА в крови характеризовалось той же кинетикой, что и ГП: обнаружение 2-х максимумов содержания МДА, в случае без замещения дефекта первый максимум установлен через 1 неделю при значении 9,6 нмоль/мг белка, а второй максимум на 5-ой неделе при значении 4,18 нмоль/мг белка. При замещении дефекта уровень первого максимума МДА достигал до 11,4 и второго максимума до 14,4 нмоль/мг белка.
У больных при удалении костной кисты увеличение содержания ГП в крови более заметно было, чем при ОБК. На фоне замещения дефекта первый максимум содержания ГП наблюдался через неделю, а второй - через 5 недель при значениях 17,8 и 19,9 нмоль/мг липида соответственно. Содержание МДА в крови больных после резекции костной кисты в максимумах было 10,2 и 6,2 нмоль/мг белка соответственно. При замещении дефекта содержание МДА через одну неделю в первом максимуме было 13 нмоль/мг протеина, через 5 недель во втором максимуме - 15,8 нмоль/мг протеина. У больных удаление фибродисплазии, костно-хрящевого экзостоза также вызывали существенное усиление интенсивности ПОЛ в крови.