Иммуноблоттинг
Одинаковые количества белка (10 мкг для митохондриальной и цитозольной фракций и 21 мкг для общей белковой фракции) смешивали с буфером для денатурации белка NuPAGE LDS Sample Buffer (Invitrogen, NP0007) в отношении 4:1 и восстановителем NuPAGE Sample Reducing Agent (Invitrogen, NP0009) в отношении 10:1 и загружали на 10-луночный гель NuPAGE 4-12% Bis-Tris толщиной 1,5 мм (Invitrogen, NP0335). В качестве маркеров молекулярных масс загружали смесь белковых стандартов Novex Sharp Pre-Stained Protein Standard (Invitrogen, LC5800) и MagicMark XP Western Protein Standard (Invitrogen, LC5602) в соотношении 1:1 (5:5 мкл). Разделение белков проводили электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии до- децилсульфата натрия в буфере NuPAGE MES SDS Running Buffer (Invitrogen, NP000202) при 150 В в течение 1 часа. Перенос белка осуществляли при помощи наборов для сухого переноса, содержащих мембрану из поливинилиденф- торида (Invitrogen, IB24001), и прибора для сухого переноса iBlot 2 (Invitrogen) в соответствии со стандартным протоколом производителя (P0, 7 минут). Блокировку неспецифического связывания осуществляли при помощи набора iBind Flex Solution Kit (Invitrogen, SLF2020) в течение 1 часа.
Иммуноблоттинг проводили с первичными антителами к цитохрому c (Abcam, ab133504, разведение 1:500), потенциал-зависимому анионоселективному каналу 1 (VDAC1, Abcam, ab235143, разведение 1:500), глицеральде- гид-3-фосфатдегидрогеназе (GAPDH, Abcam, ab139416, разведение 1:250), HtrA2/Omi (Abcam, ab75982, разведение 1:200), каспазе-9 (Abcam, ab202068, разведение 1:500), каспазе-3 (Abcam, ab208161, разведение 1:500) и вторичными конъюгированными с пероксидазой хрена антителами (Cell Signaling Technology, 7074, разведение 1:200; Sigma-Aldrich, AP130P, разведение 1:1000).
Инкубацию с антителами проводили с использованием набора iBind Flex Solution Kit, карточек для инкубации мембран с антителами iBind Flex Cards (Invitrogen, SLF2010) и прибора для инкубации мембран с антителами iBind Flex Western Device (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Хемилюминесцентную детекцию осуществляли посредством инкубации мембраны в течение 30 секунд в хемилюминесцентном субстрате SuperSignal West Pico PLUS (Thermo Scientific, 34580) с последующим 12-минутным сканированием на цифровом сканере хемилюминесцентных блотов C-DiGit (LI-COR Biosciences). Денситометрию результатов иммуноблоттинга проводили в программе ImageJ (National Institutes of Health).
Результаты и обсуждение
В результате проведенного фракционирования органелл были успешно выделены митохондриальная (образцы ФСБ-МХ, СКФБ-МХ, ИКФБ-МХ) и цитозольная (образцы ФСБ-ЦТ, СКФБ-ЦТ, ИКФБ-ЦТ) фракции белка, что было подтверждено положительными результатами иммуноблоттинга разделенных фракций на специфичный белок внешней мембраны митохондрий потенциал-зависимый анионоселективный канал 1 (VDAC1, также называемый по- рин) и специфичный фермент гликолиза (анаэробного окисления в цитозоли) глицеральде- гид-3-фосфатдегидрогеназу (GAPDH, рисунок 1). В общей белковой фракции логично наблюдали наличие обоих этих белков (рисунок 1).
Результаты, полученные в эксперименте (рисунок 1), продемонстрировали различное содержание изученных маркеров внутреннего пути апоптоза в исследованных образцах. В зависимости от формы КФБ образцы выделенного из первичных артериальных эндотелиальных клеток белка различались как по спектру, так и по содержанию специфических белков. Независимо от экспериментальной группы во всех образцах наблюдали присутствие цитохрома с и HtrA2/Omi в митохондриях, что соответствует физиологической норме (рисунок 1). При этом воздействие СКФБ и ИКФБ не всегда сопровождалось транслокацией данных белков из митохондрий в цитозоль (рисунок 1), что требует дальнейшего изучения данного вопроса.
С этой целью было проведено три независимых эксперимента для анализа уровня инициирующеи каспазы внутреннего пути апоптоза (каспазы-9) и эффекторной апоптотиче- ской каспазы (каспазы-3) в общей и активной формах. Лишь один эксперимент из трех (с первичными эндотелиальными клетками коронарной артерии) показал стойкое повышение уровня активной каспазы-9 и каспазы-3 в экспонированных СКФБ клетках в сравнении с контрольной группой (ФСБ), в то время как в остальных каспазы либо детектировались нестабильно, либо уровень активных каспаз не различался между контрольной и опытными группами (рисунок 2). Стоит отметить, что уровни общей и активной каспазы-9 и каспазы-3 характеризовались конкордантно- стью, что свидетельствует о прямой корреляции между данными апоптотическими ферментами.
Рис.1
Определение уровня специфических белков в митохондриальной, цитозольной и общей фракциях белка, выделенного из первичных эндотелиальных клеток коронарной артерии после воздействия СКФБ и ИКФБ, при помощи имму- ноблоттинга. ФСБ - фосфатно-солевой буфер (контрольная группа); СКФБ - сферические кальций-фосфатные бионы; ИКФБ - игольчатые кальций-фосфатные бионы, МХ - митохондрии, ЦТ - цитозоль, УРДС1 - потенциал-зависимый анионоселективный канал 1, СДРРН - глицеральдегид-3-фос- фатдегидрогеназа. Слева указана молекулярная масса исследованных белков (в кДа).
Рисунок 2
Определение уровня инициирующей каспазы внутреннего пути апоптоза (каспазы-9) и регулируемой ей эффекторной каспазы (каспазы-3) в общей фракции белка, выделенного из первичных эндотелиальных клеток внутренней грудной или коронарной артерии после воздействия СКФБ и ИКФБ, при помощи иммуноблоттинга. ФСБ - фосфатно-солевой буфер (контрольная группа); СКФБ - сферические каль-ций-фосфатные бионы; ИКФБ - игольчатые кальций-фос-фатные бионы. Слева указана молекулярная масса исследо-ванных белков (в кДа).
Figure 2. Western blotting measurements of the initiator caspase of intrinsic apoptosis (caspase-9) and its downstream effector caspase (caspase-3) in the total protein extracted from primary human coronary artery and internal thoracic artery endothelial cells optionally treated with CPB. PBS - phosphate-buffered saline (control group), CPB-S - spherical calcium phosphate bions, CPB-N - needle-shaped calcium phosphate bions. Molecular weight of the mentioned proteins is indicated
Представленные результаты показали неоднозначность механизмов эндотелиотоксического действия КФБ и необходимость дальнейшей расшифровки путей клеточной гибели под воздействием СКФБ и ИКФБ. В частности, экспозиция первичных артериальных эндотелиальных клеток КФБ, хотя и стабильно сопровождается гибелью значительной их части [1, 9, 15] и выделением провоспалительных цитокинов [6], не всегда сопровождается транслокацией цитохрома с и HtгA2/Omi из митохондрий в цитозоль, при этом также не происходит повышения уровня активной каспазы-9 и каспазы-3.
В то же время повышение количества активной каспазы-9 в обязательном порядке сопровождалось увеличением уровня активной каспазы-3, что согласуется с данными литературы [21-23]. В целом эксперименты в этом отношении демонстрируют довольно разнонаправленные результаты, что может свидетельствовать о необходимости совершенствования методики оценки молекулярных путей клеточной гибели под воздействием КФБ, к примеру, введения в протокол обязательного центрифугирования культуральной жидкости для сбора открепившихся от пластика в результате гибели клеток.
Литература / References
кровь эндотелиальный органический
1. Kutikhin AG, Velikanova EA, Mukhamadiyarov RA, Glush- kova TV, Borisov VV, Matveeva VG, Antonova LV, Filip'ev DE, Golovkin AS, Shishkova DK, Burago AY, Frolov AV, Dolgov VY, Efimova OS, Popova AN, Malysheva VY, Vladimirov AA, Sozinov SA, Ismagilov ZR, Russakov DM, Lomzov AA, Pyshnyi DV, Gutakovsky AK, Zhivodkov YA, Demidov EA, Peltek SE, Dolganyuk VF, Babich OO, Grigoriev EV, Brusi- na EB, Barbarash OL, Yuzhalin AE. Apoptosis-mediated endothelial toxicity but not direct calcification or functional changes in anti-calcification proteins defines pathogenic effects of calcium phosphate bions. Sci Rep. 2016;6:27255. https://doi. org/10.1038/srep27255
2. Smith ER, Hewitson TD, Jahnen-Dechent W. Calciprotein particles: mineral behaving badly? Curr Opin Nephrol Hypertens. 2020;29(4):378-386. https://doi.org/ 10.1097/ MNH.0000000000000609
3. Herrmann M, Schдfer C, Heiss A, Grдber S, Kinkeldey A, Bьscher A, Schmitt MM, Bornemann J, Nimmerjahn F, Herrmann M, Helming L, Gordon S, Jahnen-Dechent W. Clearance of fetuin-A--containing calciprotein particles is mediated by scavenger receptor-A. Circ Res. 2012;111(5):575- 584. https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.111.261479
4. Kцppert S, Bьscher A, Babler A, Ghallab A, Buh! EM, Latz E, Hengstler JG, Smith ER, Jahnen-Dechent W. Cellular Clearance and Biological Activity of Calciprotein Particles Depend on Their Maturation State and Crystallinity. Front Immunol. 2018;9:1991. https://doi.org/ 10.3389/fimmu.2018.01991
5. Peng HH, Wu CY, Young D, Martel J, Young A, Ojcius DM, Lee YH, Young JD. Physicochemical and biological properties of biomimetic mineralo-protein nanoparticles formed spontaneously in biological fluids. Small. 2013;9(13):2297-2307. https://doi.org/10.1002/smll.201202270
6. Шишкова Д.К., Синицкий М.Ю., Великанова Е.А., Кутихин А.Г. Кальций-фосфатные бионы индуцируют секрецию провоспалительных цитокинов интерлейкина-6 и интерлейкина-8 артериальными эндотелиальными клетками in vitro. Цитокины и воспаление. 2018;17(1-4):80 [Shishkova DK, Sinitsky MYu, Velikanova EA, Kutikhin AG. Calcium phosphate bions induce secretion of pro-inflammatory cytokines interleukin-6 and interleukin-8 by arterial endothelial cells in vitro. Cytokines and Inflammation. 2018;17(1-4):80. (In Russ.).]
7. Cahill PA, Redmond EM. Vascular endothelium- Gatekeeper of vessel health. Atherosclerosis. 2016;248:97-109. https://doi. org/ 10.1016/j.atherosclerosis.2016.03.007
8. Young JD, Martel J, Young D, Young A, Hung CM, Young L, Chao YJ, Young J, Wu CY. Characterization of granulations of calcium and apatite in serum as pleomorphic mineralo- protein complexes and as precursors of putative nanobacteria. PLoS One. 2009;4(5):e5421. https://doi.org/10.1371/journal. pone.0005421
9. Кутихин А.Г., Великанова Е.А., Шишкова Д.К., Матвеева В.Г., Григорьев Е.В., Барбараш О.Л. Форма кальций-фос- фатных бионов определяет их токсичность для культур эндотелиальных клеток человека. Кардиологический вестник. 2019;XIV(4):34-41 [Kutikhin AG, Velikanova EA, Shishkova DK, Matveeva VG, Grigoriev EV, Barbarash OL. Shape of calcium phosphate bions dictates their toxicity for human venous and arterial endothelial cells. Cardiology Bulletin. 2019;XIV(4):34-41. (In Russ.).] https://doi.org/10.36396/ MS.2019.15.4.004
10. Lebre F, Sridharan R, Sawkins MJ, Kelly DJ, Obrien F, Lavelle EC. The shape and size of hydroxyapatite particles dictate inflammatory responses following implantation. Sci Rep. 2017;7(1):2922. https://doi.org/10.1038/s41598-017- 03086-0
11. Sukhanova A, Bozrova SV, Sokolov PY, Berestovoy MA, Karaulov A, Nabiev I. Dependence of Nanoparticle Toxicity on Their Physical and Chemical Properties. Nanoscale Res Lett. 2018;13(1):44. https://doi.org/10.1186/s11671-018-2457-x
12. Galluzzi L, Vitale I, Aaronson SA, Abrams JM, Adam D, Agostinis P, Alnemri ES, Altucci L, Amelio I, Andrews DW, Annic- chiarico-Petruzzelli M, Antonov AV, Arama E, Baehrecke EH, Barlev NA, Bazan NG, Bernassola F, Bertrand MJM, Bianchi K, Blagosklonny MV, Blomgren K, Borner C, Boya P, Brenner C, Campanella M, Candi E, Carmona-Gutierrez D, Cecco- ni F, Chan FK, Chandel NS, Cheng EH, Chipuk JE, Cidlows- ki JA, Ciechanover A, Cohen GM, Conrad M, Cubillos-Ruiz JR, Czabotar PE, D'Angiolella V, Dawson TM, Dawson VL, De Laurenzi V, De Maria R, Debatin KM, DeBerardinis RJ, Deshmukh M, Di Daniele N, Di Virgilio F, Dixit VM, Dixon SJ, Duckett CS, Dynlacht BD, El-Deiry WS, Elrod JW, Fimia GM, Fulda S, Garcia-Saez AJ, Garg AD, Garrido C, Gavathio- tis E, Golstein P, Gottlieb E, Green DR, Greene LA, Gronemeyer H, Gross A, Hajnoczky G, Hardwick JM, Harris IS, Hengart- ner MO, Hetz C, Ichijo H, Jддttelд M, Joseph B, Jost PJ, Juin PP, Kaiser WJ, Karin M, Kaufmann T, Kepp O, Kimchi A, Kit- sis RN, Klionsky DJ, Knight RA, Kumar S, Lee SW, Lemas- ters JJ, Levine B, Linkermann A, Lipton SA, Lockshin RA, Lopez-Otm C, Lowe SW, Luedde T, Lugli E, MacFarlane M, Madeo F, Malewicz M, Malorni W, Manic G, Marine JC, Martin SJ, Martinou JC, Medema JP, Mehlen P, Meier P, Melino S, Miao EA, Molkentin JD, Moll UM, Munoz-Pinedo C, Naga- ta S, Nunez G, Oberst A, Oren M, Overholtzer M, Pagano M, Panaretakis T, Pasparakis M, Penninger JM, Pereira DM, Per- vaiz S, Peter ME, Piacentini M, Pinton P, Prehn JHM, Puth- alakath H, Rabinovich GA, Rehm M, Rizzuto R, Rodrigues CMP, Rubinsztein DC, Rudel T, Ryan KM, Sayan E, Scorrano L, Shao F, Shi Y, Silke J, Simon HU, Sistigu A, Stockwell BR, Strasser A, Szabadkai G, Tait SWG, Tang D, Tavernarakis N, Thorburn A, Tsujimoto Y, Turk B, Vanden Berghe T, Vanden- abeele P, Vander Heiden MG, Villunger A, Virgin HW, Vous- den KH, Vucic D, Wagner EF, Walczak H, Wallach D, Wang Y, Wells JA, Wood W, Yuan J, Zakeri Z, Zhivotovsky B, Zitvogel L, Melino G, Kroemer G. Molecular mechanisms of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death Differ. 2018;25:486-541. https:// doi.org/10.1038/s41418-017-0012-4
13. Droga-Mazovec G, Bojic L, Petelin A, Ivanova S, Romih R, Repnik U, Salvesen GS, Stoka V, Turk V, Turk B. Cysteine cathepsins trigger caspase-dependent cell death through cleavage of bid and antiapoptotic Bcl-2 homologues. J Biol Chem. 2008;283(27):19140-19150. https://doi.org/10.1074/ jbc.M802513200
14. Bidиre N, Lorenzo HK, Carmona S, Laforge M, Harper F, Dumont C, Senik A. Cathepsin D triggers Bax activation, resulting in selective apoptosis-inducing factor (AIF) relocation in T lymphocytes entering the early commitment phase to apoptosis. J Biol Chem. 2003;278(33):31401-31411. https://doi. org/10.1074/jbc.M301911200
15. Шишкова Д.К., Великанова Е.А., Мухамадияров Р.А., Южалин А.Е., Кудрявцева Ю.А., Попова А.Н., Руссаков Д.М., Кутихин А.Г. Изучение механизма специфичной эн- дотелиотоксичности кальций-фосфатных бионов. Сибирский научный медицинский журнал. 2019;39(4):12-21 [Shis- hkova DK, Velikanova EA, Mukhamadiyarov RA, Yuzhalin AE, Kudryavtseva YuA, Popova AN, Russakov DM, Kutikh- in AG. Lysosome-dependent cell death defines specific endothelial toxicity of calcium phosphate bions. Sibirskiy nauchnyy meditsinskiy zhurnal. 2019;39(4):12-21. (In Russ.).] https:// doi.org/10.15372/SSMJ20190402
16. Kim HE, Du F, Fang M, Wang X. Formation of apoptosome is initiated by cytochrome c-induced dATP hydrolysis and subsequent nucleotide exchange on Apaf-1. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(49):17545-17550. https://doi.org/ 10.1073/ pnas.0507900102
17. Reubold TF, Eschenburg S. A molecular view on signal transduction by the apoptosome. Cell Signal. 2012;24(7):1420- 1425. https://doi.org/10.1016/j.cellsig.2012.03.007
18. Yuan S, Akey CW. Apoptosome structure, assembly, and procaspase activation. Structure. 2013;21(4):501-515. https:// doi.org/10.1016/j.str.2013.02.024
19. Zou H, Li Y, Liu X, Wang X. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J Biol Chem. 1999;274(17):11549-11556. https://doi.org/10.1074/jbc.274.17.11549
20. Li Y, Zhou M, Hu Q, Bai XC, Huang W, Scheres SH, Shi Y. Mechanistic insights into caspase-9 activation by the structure of the apoptosome holoenzyme. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114(7):1542-1547. https://doi.org/10.1073/ pnas.1620626114
21. Shi Y. Caspase activation, inhibition, and reactivation: a mechanistic view. Protein Sci. 2004;13(8):1979-1987. https://doi. org/10.1110/ps.04789804
22. Lavrik IN, Golks A, Krammer PH. Caspases: pharmacological manipulation of cell death. J Clin Invest. 2005;115(10):2665- 2672. https://doi.org/10.1172/JCI26252
23. Li P, Nijhawan D, Budihardjo I, Srinivasula SM, Ahmad M, Alnemri ES, Wang X. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptot- ic protease cascade. Cell. 1997;91(4):479-489. https://doi. org/10.1016/s0092-8674(00)80434-1
24. Fujita E, Egashira J, Urase K, Kuida K, Momoi T. Caspase-9 processing by caspase-3 via a feedback amplification loop in vivo. Cell Death Differ. 2001;8(4):335-344. https://doi. org/10.1038/sj.cdd.4400824
25. Bratton SB, Walker G, Srinivasula SM, Sun XM, Butterworth M, Alnemri ES, Cohen GM. Recruitment, activation and retention of caspases-9 and -3 by Apaf-1 apoptosome and associated XIAP complexes. EMBO J. 2001;20(5):998-1009. https://doi.org/10.1093/emboj/20.5.998